Реферат на тему: "Применение ЯМР в спектроскопии анализа лекарственных средств"

 

                                              ОГЛАВЛЕНИЕ

 

Введение………………………………………………………………………....3

Глава 1. ЯМР- спектроскопия, сущность, методика………………………….5

1.1.Сущность    явления ядерного  магнитного  резонанса…………………..5

1.2. Протонный магнитный резонанс………………………………………….8

1.3.Регистрация сигнала в анализе, методика определения…………………11

Глава 2. ЯМР - спектроскопия в  анализе лекарственных средств………….15

2.1.Возможности ЯМР в спектроскопии в  анализе лекарственных средств.15

2.2.Практическое применение метода ЯМР…………………………………..16

2.3. Сравнение возможности ЯМР-спектроскопии с ВЭЖХ…………………19

Заключение………………………………………………………………………23

Литература……………………………………………………………………….24

Приложение……………………………………………………………………...26

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                            ВВЕДЕНИЕ

           Открытие ядерного магнитного резонанса  имеет весьма длинную предысторию. Так представления о том, что электрон и атомные ядра имеют собственные магнитные моменты, было введено в физику ещё В. Паули ( за что получил в 1945году нобелевскую премию по физике)[3], затем Отто Штерн вместе с Вальтером Герлахом экспериментально подтвердили это в опытах с атомными и молекулярными пучками. В 1952 году была присуждена нобелевская премия по физике двум американцам Феликсу Блоху (Стенфордский университет) и Эдварду Перселлу (Гарвардский университет)  с формулировкой –за развитие новых методов для точных ядерных магнитных измерений и связанные с этим открытия[5]. Затем  в 1991 году нобелевская премия по химии, была присуждена швейцарскому химику Рихарду Эрнсту с формулировкой – за вклад в развитие методологии ядерной магнитной резонансной спектроскопии высокого разрешения, его разработки позволили кардинально увеличить информативность ЯМР-экспериментов[5] . В 2002году премия была присуждена Курту Вютриху с формулировкой –  за разработку применения ЯМР-спектроскопии для определения трёхмерной структуры биологических макромолекул в растворе[3,5]. До этого единственным методом, позволяющим определять пространственную структуру больших био-макромолекул, был только рентгеноструктурный анализ. Наконец, в 2003 году премию по медицине за изобретение ЯМР-томографии получили американец Поль Лаутербур и англичанин Петер Мансфилд[5].  

     Так медицина, аналитическая химия, биохимия, вот некоторые направления, которые используют данный метод анализа, ведь он является    одним  из  самых  информативных  методов при исследовании структуры и динамических превращений молекул, межмолекулярных взаимодействий, механизмов химических реакций и количественного анализа веществ. Но может ли данный метод анализа применятся в анализе лекарственных средств, в этом заключается актуальность темы нашего исследования.

      Целью работы является, изучить возможности применения ядерного магнитного резонанса  в спектроскопии анализа лекарственных средств

Для достижения цели нами поставлены следующие задачи:

1.     Рассмотреть физические законы лежащие в основе метода ЯМР- спектроскопии.

2.     Изучить методику анализа и аппаратное обеспечение эксперимента.

3.     Рассмотреть возможности применение данного метода для анализа фармацевтических препаратов.

4.     Провести сравнительную характеристику ЯМР- спектроскопии с ВЭЖХ методом анализа

5.     Обобщить и сделать выводы.

Теоретической основой написания данной работы являются научные статьи , диссертации и интернет источники на данную тему.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 1. ЯМР- спектроскопия, сущность, методика

1.1.Сущность    явления ядерного  магнитного  резонанса

    Спектроскопия  ядерного  магнитного  резонанса, это такой вид спектроскопии, которая регистрирует переходы между магнитными энергетическими уровнями атомных ядер, вызываемые радиочастотным излучением. Поскольку ядерный магнетизм является весьма сложным физическим понятием, для его описания привлекается математический аппарат квантовой механики.

       Итак, если представить себе ядро атома в виде вращающегося положительно заряженного шарика, то мы увидим, что заряд вращается по кольцевой орбите, порождая микроскопический кольцевой ток. Т.к. кольцевой ток индуцирует магнитное поле, такое ядро представляет собой не что иное, как микроскопический магнит. Магнитный момент ядра направлен вдоль оси вращения, и его можно уподобить крошечному стержневому магниту с характерными спиновыми и магнитными моментами. Если этот магнитный момент поместить в постоянное внешнее поле, то вектор этого момента начинает прецессировать,  вокруг направления внешнего поля. 

Рис.1-Простой пример сущности магнитного резонанса ядра атома

 

Частота прецессии определяется как свойствами ядра, так и силой магнитного поля: чем сильнее поле, тем выше частота. Затем, если кроме постоянного внешнего магнитного поля на ядро будет воздействовать переменное магнитное поле, то ядро начинает взаимодействовать с этим полем — оно как бы сильнее раскачивает ядро, амплитуда прецессии увеличивается, и ядро поглощает энергию переменного поля. Однако это будет происходить только при условии резонанса, т. е. совпадения частоты прецессии и частоты внешнего переменного поля (рис.1).  

    Не все ядра атомов могут вызвать резонанс, ток мы знаем, что кроме массового числа  М и заряда  Z , ядра атомов имеют еще одну важную характеристику как магнитный момент  μ . Не имеют магнитных моментов  μ = 0, только такие ядра, у которых  М и  Z - четные. И только ядра, имеющие магнитные моменты, могут вызывать сигнал ЯМР, и мы его зарегистрируем. В физике ядер магнитный момент характеризуется таким понятием как спиновое квантовое число. Следовательно, только ядра со спиновым квантовым числом I, отличным от «0», могут вызывать сигнал ЯМР, или быть активными в ЯМР. 

Если глубже взглянуть в физику данного явления. то существует эмпирическое правило:

·        I равно «0» для ядер с четным числом протонов и нейтронов;

·        I равно целым числам (1, 2, 3…) для ядер с нечетными числами и

протонов, и нейтронов;

·        I равно полуцелым числам (1/2, 3/2, 5/2 и т.д.) для ядер с четными

числами протонов и нечетными числами нейтронов и наоборот[9].

      В приложенном магнитном поле с напряженностью  ядро со спиновым числом I может принимать 2I+1 ориентаций (или занимать 2I+1 энергетических уровней). Количество энергии, на которое отличаются эти уровни (разность энергий уровней), возрастает с возрастанием , однако при данном значении разность энергий между двумя соседними уровнями есть величина постоянная. Разность энергий двух соседних уровней ΔЕ определяется выражением:

 dE=                                                                               (1)

     В случае протона самой низкой энергией обладает состояние, при котором вектор магнитного момента ядра параллелен вектору магнитного поля. Однако существуют ядра, с отрицательным магнитным моментом, т.е. такие, для которых более выгодна ориентация магнитного момента «против поля» (см. табл.1 приложения ).

                                     (а)

Рис.2. (а) Диаграмма уровней энергии для ядер со спинами  I =1/2 и  I =1 в поле .(б) Зависимость разности энергий уровней для протона от напряженности поля.

 

Очевидно, что если в системе существует несколько дискретных состояний с

различными энергиями, то между ними возможны переходы. В ЯМР разрешены переходы, при которых магнитное квантовое число  m I , которое может принимать значения от  –I  до +I , изменяется на  ±1 . Если воздействовать на такую систему радиочастотным полем  (это поле всегда локализуется в плоскости  xy ) с энергией кванта    = ΔЕ,  то произойдет поглощение этого кванта. В результате система перейдет из нижнего состояния на более высокое, и это поглощение может быть зарегистрировано.

Регистрация таких переходов и составляет основу спектроскопии ЯМР[9,10,12].

     И так ядер не имеющих магнитного момента, и которые не могут быть зарегистрированы  не так много, это изотопы  и некоторые другие, а все другие ядра, это 118 стабильных изотопов 104 известных химических элементов Периодической системы Менделеева, имеют магнитные моменты, и для них можно наблюдать ЯМР. Эти магнитные ядра различаются по величине магнитных моментов и по значению ядерного спина I. То есть из вышесказанного следует, что  изотоп углерода  или кислородаявляясь немагнитными, не регистрируются в ЯМР-спектрах, а изотопы углерода  или кислорода обладают магнитным моментом и регистрируются в ЯМР-спектрах. Характеристики некоторых важных магнитных ядер приведены в приложении таблица 1.

 

1.2. Протонный магнитный резонанс

     Протонный магнитный резонанс, или по другому называется ЯМР ¹Н наиболее популярный . Существует ещё ЯМР¹³С .Так как  ядро¹²С диамагнитно спиновое число равно 0. Однако ядро  ¹³С, как и протон, имеет спин ½. Поскольку природное содержание изотопа¹³С составляет только 1.1%, а чувствительность ядра ¹³С (большое значение времени релаксации) составляет лишь 1.6% от чувствительности протона, общая чувствительность метода ЯМР¹³С равна ~1/5700 от чувствительности ЯМР ¹Н[14]

    Методика определения заключается в следующем ( о ней подробней мы остановимся во второй главе): так ампулу с образцом , предворительно растворённом в дейтерированном растворителе ( таблица 2 приложения) помещают между полюсами сильного магнита. В магнитном поле протоны мгновенно ориентируются в направлении поля . В первый момент после внесения образца число ядер, ориентированных вдоль поля и против поля, одинаково это50% на 50% ( рис.3).

Рис.3 Ориентация протонов под действием внешнего магнитного поля

 

Вследствие обмена энергией между системами ядер и их окружением число ядер на нижнем энергетическом уровне достаточно быстро возрастает до величины, чуть большей 50%.Протоны, ориентированные вдоль поля, находятся в более низком энергетическом состоянии, чем протоны, ориентированные против магнитного поля. Мы помним, что в конечном итоге ΔЕ = hν; это означает, что должна существовать такая частота электромагнитного излучения, которая окажется равной разности энергий между более высоким энергетическим состоянием (ориентация против )и более низким его состоянием (ориентация вдоль). Если на ядро воздействовать именно этой частотой, оно будет взаимодействовать с излучением и изменит свое энергетическое состояние. Те ядра, которые находились в более высоком энергетическом состоянии, перейдут на нижний уровень, и наоборот. Однако, поскольку на нижнем энергетическом уровне существует некоторый избыток ядер, в более высокое энергетическое состояние перейдет большее число ядер, и в результате взаимодействия ядер с излучением данной частоты произойдет поглощение электромагнитного излучения. Именно это поглощение и вызывает сигнал ЯМР. Точное значение частоты, которая вызывает переходы между энергетическими уровнями данного ядра, называется резонансной частотой этого ядра.

Резонанса можно достичь и другим путем: оставляя частоту постоянной, менять напряженность магнитного поля. Во многих спектрометрах ЯМР используют генератор фиксированной частоты 200, 300, 400, 500 и даже 800 МГц[15].

      Для существования различия в заселенности энергетических уровней необходим перенос энергии молекулярного движения на спины ядер. Различие в заселенности возникает только в том случае, если после наложения магнитного поля, т.е. с того момента, когда ядра окажутся в магнитном поле, проходит некоторое время. Это время называется временем спин-решеточной релаксации. Величина времени спин-решеточной релаксации имеет важное значение. Если время релаксации мало (у ядер быстрый перенос энергии), то сигнал ЯМР уширенный. Большое время релаксации, например, у ядер¹³С также затрудняет наблюдение сигналов

поглощения: столь важное для резонанса различие в заселенности уровней при наложении относительно сильного переменного поля выравнивается быстрее, чем его удается обнаружить (сигнал как таковой исчезает). Последнее обстоятельство является одной из причин более низкой чувствительности метода ЯМР¹³С по сравнению с ЯМР¹Н[7].

Основными характеристиками спектров ЯМР являются:

·        химический сдвиг,

·        мультиплетность,

·        константа спин - спинового взаимодействия;

·        площадь сигнала резонанса.

Эти характеристики зависят от химического окружения данного ядра или группы ядер, от числа соседних ядер, обладающих магнитным моментом, от их относительного расположения, а также от числа анализируемых ядер в различных структурных фрагментах молекулы.

 

1.3.Регистрация сигнала в анализе, методика определения

     Существуют две возможности провести эксперимент по наблюдению ЯМР. На рис.4 показана блок-схема спектрометра ЯМР, работающего в режиме «непрерывной развертки».

Рис.4 Схема простейшего спектрометра ЯМР для наблюдения спектров в режиме непрерывной развертки

     Главная часть прибора – магнит, создающий  высокооднородное  постоянное  поле .  В  его  зазоре  находится радиочастотная катушка, внутри которой расположена ампула с образцом. Катушка соединена с генератором радиочастотного поля  и приемником, основу которого составляет радиочастотный мост, выделяющий сигнал поглощения. После усиления этот сигнал регистрируется самописцем. Таким образом, спектр ЯМР представляет собой график в координатах «интенсивность сигнала поглощения – частота радиочастотного поля.

      Существует и импульсный метод наблюдения ЯМР. Схема данного метода представлена на рисунке 5.

Рис.5. Схема импульсного спектрометра ЯМР

И здесь сердце прибора – магнит с радиочастотным контуром и образцом в его зазоре. В этом случае в контур подается мощный (50 ватт или больше) короткий радиочастотный импульс длительностью  τ = 10-50 мкс с частотой, близкой к  .  Он возбуждает все частоты в диапазоне ±1/τ . Мощность и длительность импульса чаще всего выбирают так, чтобы заселенности нижнего и верхнего уровней выровнялись. Такой импульс называют 90 градусным или π/2-импульсом. Стремясь вернуться в состояние теплового равновесия, ядерные спины начинают рассеивать полученную ими избыточную энергию в виде радиоизлучения. Его и зарегистрирует катушка нашего датчика в виде интерферограммы – суперпозиции затухающих гармонических колебаний. Этот сигнал с помощью аналого-цифрового преобразователя переводят в цифровую форму. И после Фурье-преобразования, и мы получим обычный спектр.

     В качестве расшифровки спектра рассмотрим спектр 4-иод-3-нитроанизола (рис.6) растворитель , частота прибора 300 МГц

 

Рис.6 Спектр ЯМР ¹Н 4-иод-3-нитроанизола

Прежде всего, отметим, что собственно спектр¹Н представлен в нижней части рисунка; в верхней части представлена увеличенная область спектра, где наблюдаются сигналы 4-иод-3-нитроанизола.

Этапы интерпретации спектра:

А)Необходимо  найти  и  исключить  из  спектра  сигнал  от растворителя; в нашем случае – , сигнал наблюдается при 7.26 м.д. (сигнал низкой интенсивности) Мы его видим на схеме в виде мелкой волны.

Б) Определим количество групп неэквивалентных протонов.

В нашем случае четыре группы неэквивалентных протонов: три протона метокси группы и три протона ароматического кольца. То есть, в спектре мы должны наблюдать четыре сигнала с относительной интенсивностью 3:1:1:1. Именно такую картину мы и видим: сигнал с относительной интенсивностью  3.023, далее сигнал с относительной интенсивностью    0.990, затем сигнал с относительной интенсивностью  1.004 и, наконец, сигнал с относительной интенсивностью  1.000.

В) Сигнал от протонов метокси группы наблюдается в виде синглета в области 3.82 м.д.

Г) Отнесение оставшихся сигналов не столь однозначно. Нам необходимо  одновременно  руководствоваться  знаниями  о мультиплетности сигнала и факторах, влияющих на химический сдвиг.

 

Протон  №4  является  наиболее  дезэкранированным (электроноакцепторное влияние соседнего атома иода). Его сигнал должен наблюдаться в виде дублета с J ~ 8 Гц [1, 2]. Действительно, в спектре присутствует дублет при 7.81 м.д., J = 8.7 Гц.

Протон №3 должен быть наименее дезэкранированным, его сигнал теоретически также должен наблюдаться в виде дублета. Однако, в области 6.81 - 6.84 имеется мультиплет (специальное название «дублет-дублет»).  Его  происхождение  объясняется  спин-спиновым взаимодействием  протона  №3  с  протоном  №4  и  «дальним» взаимодействие с протоном №1.

Сигнал протона № 1 теоретически должен наблюдаться в виде синглета. Однако вследствие дальнего взаимодействия с протоном №3 в спектре имеется узкий дублет с J = 2.7 Гц.

Приводим полное описание спектра. Спектр ¹Н , , δ м.д: с. 3.82 (3Н), д.-д. 6.81 – 6.85 м.д., J = 8.7 Гц, J =2.7 Гц (1 Н); д. 7.35, J = 2.7 Гц (1 Н); д. 7.81, J = 8.7 Гц (1 Н).

 

Глава 2. ЯМР - спектроскопия в  анализе лекарственных средств

2.1.Возможности ЯМР в спектроскопии в  анализе лекарственных средств

       Одним из основных направлений совершенство­вания методологии фармацевтической экспертизы лекарственных средств яв­ляется разработка и внедрение новых аналитических методов контроля качества лекарственных средств, основанных на совре­менных технологиях. Сейчас предпочтение отдается пря­мым недеструктивным методам анализа, отвечаю­щим требованиям информативности, быстроты, экспрессности и достоверности полученных результатов. Более других таким тре­бованиям соответствует метод спектроскопии ядер­ного магнитного резонанса.

По сравнению с другими аналитическими мето­дами метод ЯМР имеет ряд преимуществ, что позво­ляет считать его применение в фармакопейном ана­лизе полностью экономически оправданным. Он не требует использования эталонов и внутрен­них стандартов при установлении подлинности, так как решает задачу идентификации соединения на­прямую, путем определения состава, строения и про­странственной структуры соединения, является абсолютным количественным мето­дом, поэтому не требует использования стандартов при количественных измерениях. Не разрушает исследуемый образец, позволяя установить строение примесей в объекте исследова­ния, количественно определить их содержание, вы­явить сырьевую и технологическую предысторию, не требует сложной пробоподготовки, отлича­ется высокой производительностью при небольшом расходе реактивов. И главное это то, что особенности агрегатного состояния, дисперс­ность, элементный состав, молекулярно-массовое распределение и другие характеристики системы не препятствуют получению спектров ЯМР.

     В настоящее время данный метод описан в Государственной фармакопее XII издания и ведущих фармакопеях мира (Европей­ского союза, США и  Японии), где он рекомендован для установления подлинности ряда лекарственных суб­станций (например, тобрамицина, бузерелина, гозе- релина, низкомолекулярного гепарина, орфенадрина цитрата, эноксапарина натрия и др.)[13]. Для определе­ния других показателей качества ЛС (идентификация примесей и остаточных органических растворителей, количественное определение, исследование стабиль­ности) по-прежнему применяют традиционные фи­зико-химические методы анализа, в первую очередь различные варианты хроматографии (ГЖХ, ВЭЖХ, тонкослойная хроматография), а также ИК-спектро­скопию и УФ-спектрофотометрию , характерной особенностью которых является необходимость ис­пользования стандартных образцов[6].

 

 2.2.Практическое применение метода ЯМР

       Исходя из того что мы раскрыли в первой главе, пробоподготовка в рамках данного метода очень проста и заключается в растворении препарата в под­ходящем дейтерированном растворителе (как прави­ло, используется не более 0,5-0,7 мл растворителя). Это связано с тем, что интенсивность сигнала недейтерированного растворителя в протонном спектре всегда будет значительно превышать сигналы растворенного продукта, а также в ряде случаев перекрывать их. Это приводит к уменьшению количества информации, которую можно извлечь из спектра. Список дейтерированных растворителей у нас приведено в таблице 2 приложения. Приготовленный раствор можно использовать для решения большинства химико-аналитических задач фармакологической экспертизы (подтверждение подлинности, идентификация и количественное оп­ределение примесей и остаточных органических рас­творителей, содержание основного компонента и т.д.).

Задача подтверждения подлинности решается на­прямую путем определения состава, строения и про­странственной структуры соединения, при этом фик­сируется наличие определенных структурных фраг­ментов и последовательность их соединения друг с другом в молекуле. В случае, когда идентифициро­вать конкретное строение активного компонента лекарственного средства  невозможно (например, активный компонент явля­ется полимером нерегулярного строения и не имеет конкретной общей формулы) используют спектры ЯМР целиком. Как правило, предпочтение отдают углеродным спек­трам, поскольку в спектрах ¹³С практически не на­блюдается перекрывания сигналов вследствие более широкого диапазона химических сдвигов ¹³С. Кроме того, спектры ¹³С позволяют определять содержание четвертичных углеродных атомов и функциональных групп, не содержащих протоны. Следует отметить, что при отсутствии какой-либо информации о струк­турной интерпретации данных одномерных спектров (ЯМР ¹Н и ¹³С) дополнительно регистрируют ряд корреляционных спектров  и спектров с переносом намагниченности. С их помощью точно определяются системы спин-взаимодействующих ядер, идентифицируются сигналы перекрывающихся протонных мультиплетов, устанавливаются взаимное соотнесение сигна­лов ¹Н и ¹³С конкретных углеводородных фрагментов и последовательность соединения различных струк­турных фрагментов в молекуле. В дальнейшем, для идентификации соединений, для которых уже прове­дена структурная интерпретация спектральных дан­ных, проведение двумерных экспериментов необяза­тельно[2,4,6].

Применение ЯМР-спектроскопии в количест­венном анализе основано на прямой пропорциональ­ности молярной концентрации магнитно-активных ядер интегральной интенсивности соответствующего сигнала поглощения в спектре. При количественном определении любого компонента фармацевтических субстанций (как основного, так и примесного) доста­точно сопоставления приведенной интегральной ин­тенсивности сигнала данного компонента к сумме приведенных интегральных интенсивностей сигна­лов всех компонентов фармацевтических субстанций. В рамках метода ЯМР задачи подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей (включая остаточные органи­ческие растворители), решаются параллельно, на ос­нове использования одной пробы образца, без приго­товления серии калибровочных растворов сравнения приме­сей и остаточных растворителей. Аппаратур­ные возможности современных импульсных ЯМР-спектрометров со сверхпроводящими магнита­ми позволяют фиксировать примеси на уровне сотых долей процента, и в отличие от традици­онных хроматографических методов, метод ЯМР по­зволяет фиксировать все примеси, присутствующие в анализируемом образце, в то время как хроматогра­фические методы — только те примеси, которые наблюдаются при выбранных условиях хроматогра­фирования[9].      Подтверждение правильности данной концепции мы рассмотрим в следующем параграфе.

Точность интегрирования сигнала в спектре ЯМР, при проведении количественных измерений, зависит только от соотношения «сигнал - шум» (S/N):

x(I)%=0,25                                                                               (2)

где x(I) — стандартная неопределенность интегри­рования.

Для того, чтобы неопределенность интегрирова­ния не превышала 1 %, величина S/N не должна быть ниже 150.

Спектроскопия ЯМР ¹³С малоэффективна при идентификации и количественном определении микропримесей. Это связано с низкой чувствитель­ностью метода ¹³С-ЯМР, поэтому задачи количест­венного определения примесей решают с помощью метода ¹Н-ЯМР, который чувствительнее метода ¹³С-ЯМР как мы выше отмечали[12,14].

 

 

 

 

2.3. Сравнение возможности ЯМР-спектроскопии с ВЭЖХ

    В качестве примера рассмотрим количественное определение примесей, которое содержится в дигидрокверцетине, с помощью двух методов анализа ЯМР-спектроскопии и ВЭЖХ.

      Дигидрокверцетин - флавоноид, получаемый из древесины лиственницы сибирской  и лиственницы даурской . Его  фармакологическое действие - противоотечное, антиоксидантное, дезинтоксикационное, капилляропротективное.

 

(2R,3R)-2-(3,4-Дигидроксифенил)-3,5,7-тригидрокси-2,3-дигидрохромен-4-он

Стандартным методом контроля качества для ди­гидрокверцетина является ВЭЖХ. Методика определения данным способом заключается в следующем:

1 г из­мельченных таблеток или содержимого капсул поме­щают в мерную колбу вместимостью 250см³, добавля­ют туда 50 см³ подвижной фазы (ацетонитрил — 2 % :уксусная кислота в соотношении (30:70)), встряхивают 30 мин, дово­дят подвижной фазой до метки и тщательно переме­шивают. Полученный раствор фильтруют через капро­новый фильтр или центрифугируют при 3000 об/минуту, 5 мин.

Условия хроматографического анализа:

·        колонка Hypersil ODS, размер колонки 250 х 4,6 мм,

·         размер частиц 5 мкм,

·        подвижная фаза — ацетонитрил — 2% уксусная кислота (30:70),

·        скорость подвижной фазы 1,0см³/мин,

·        объем петли инжектора 20 мм³,

·         УФ-детектор, длина волны 287 нм.

Времена удерживания не­которых флаванонолов: дигидрокверцетин — 5 минут, дигидрокемпферол — 6,5 минут, эриодиктиол —7,5 минут.При количественном анализе данного препарата  используют метод аб­солютной калибровки. Относительное стандартное от­клонение, вычисленное по площадям пиков не менее 2 параллельных измерений дигидрокверцетина, не должно превышать 0,4 %. С целью сравнения результатов методов мы рассмотрим серию экспериментов по контролю качества образ­цов дигидрокверцетина, это дигидрокверцетина-сырца и эталонного чис­того дигидрокверцетина. Все образцы серии были охарактеризованы с помо­щью ВЭЖХ (по приведенной выше методике) и с по­мощью спектроскопии ЯМР на ядрах ¹H. Хроматограммы неочищенного сырья и чистого дигидрокверцетина (рис. 4,5) почти не различаются между собой , в отличие от спектров ЯМР той же пары образцов ­(рис. 6)

Рис.4-Хроматограмма чистого дигидрокверцетина

 

В отличие от ВЭЖХ, по протонным спектрам ЯМР можно качественно и количест­венно идентифицировать дигидрокверце­тин, кверцетин, родственные им флавоноиды, такие как нарингенин, кемпферол, дигидрокемпферол и т.п., полиме­ры дигидрокверцетина  (техническая примесь при экстракции дигидрокверцетина из растительного сы­рья), окисленные формы дигидрокверцетина, техноло­гические примеси, попадающие в образец при экс­тракции (в частности, ацетон).

Рис.5 Хроматограмма неочищенного дигидрокверцетина

Рис.6 Сравнение спектров ЯМР на ядрах ¹H очищенного и не очищенного образца дигидрокверцетина

 

Таким образом, мы видим явное превосходство ЯМР-спектроскопии по сравнению с ВЭЖХ. Эти преимущества и недостатки мы можем свести в таблицу.

 

 

 

 

Таблица 1.- Сравнение спектроскопии ЯМР и ВЭЖХ

ВЭЖХ

ЯМР на ядрах 1H

·         Высокочувствительный метод, предел обнаружения  -г/л; ·         Необходимы стандартные образцы на каждое вещество; ·         Для определения всех примесей требуется несколько экспериментов; ·         Подготовка образца требует времени       1 эксперимент занимает не менее 10 мин       Полное время анализа не менее 50 мин ·        Родственные соединения и оптические изомеры трудно различимы

·         Низкочувствительный метод, предел обнаружения  - г/л ·         Не требует стандартных образцов          Для определения всех примесей достаточно 1 эксперимента     Нет необходимости в      предварительной подготовке образца 1 эксперимент занимает не более 5 мин Полное время анализа менее 5 мин ·        Возможна однозначная идентификация  оптических изомеров и родственных соединений

 

 

 Конечно, оборудование для ЯМР-спектроскопии, стоит значительно дороже  оборудования для других методов анализа, даже оборудования для ВЭЖХ. Однако стоит также отметить, что, несмотря на дороговиз­ну оборудования, идентификация фармацевтических препаратов с помощью спектроскопии ЯМР при большом потоке образов может быть коммерчески более выгодной, не­жели идентификация с помощью ВЭЖХ, ввиду низкой стоимости одного протонного спектра, расходных материа­лов и небольшого приборного времени, требуемого для регистрации спектра.

 

 

 

 

 

 

 

 

                                        ЗАКЛЮЧЕНИЕ

       Спектроскопия ядерного магнитного резонанса имеет на сегодняшний день наиболее богатый и успешный опыт установления как химической структуры индивидуальных органи­ческих соединений, так и деталей их электронного и пространственного строения. Химики-органики все чаще приходят к выводу, что в настоящее время данный метод при изучении строения органических  соединений эффективнее ультрафиолетовой или

инфракрасной  спектроскопии. Вместе с тем этот метод не заменяет более старых традиционных методов химического анализа , как физических так и химических, они взаимно дополняют друг друга.

 Процедура регистра­ции спектров, сбора и обработки информации легко может быть осуществлена в автоматическом ре­жиме. Выполнение количественных измерений на основе данных ЯМР не требует при регистрации спектров использования эталонов и внутренних стандартов, так как основано на стехиометрических отношениях. Все перечисленное делает метод ЯМР универсальным средством для комплексного реше­ния химико-аналитических задач при проведении фармацевтической экспертизы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                      СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.Braune, A. Envi- ront. Microbiol./ A. Braune, Mi. Gutschow, W. Engst, and Mi. Blaut:5558-5567 (2001).137с.

2.Государственная фармакопея Российской Федерации. 12-е изд. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского при­менения; 2008. С. 73-78.

3.Калабин, Г.К Количественная спек­троскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки/ Г.К. Калабин, Л.В. Каницкая, Д.Ф.Кушнарев :- М.: Химия; 2000.-123с.

4.Кузьмина, Н.Е.  Возможности метода ЯМР-спектроскопии при определении микрокомпонентов смесей/ / Н.Е.Кузьмина, С.В. Моисеев, B.A. Яшкир, B.A. Меркулов: Журнал аналитической химии 2014; 69(11): 1152-60с.

5.Кузьмина, Н.Е. Использо­вание метода ЯМР-спектроскопии для подтверждения под­линности и оценки качества субстанций азитромицина/ Н.Е.Кузьмина, С.В. Моисеев, B.A. Яшкир, B.A. Меркулов:  Ведо­мости Научного центра экспертизы средств медицинского при­менения 2012; (1): С.10-14.

6.Кузьмина, Н.Е. Использование метода мультиядерной ЯМР-спектроскопии для определения качест­ва лекарственных субстанций/ Н.Е.Кузьмина, С.В. Моисеев, B.A. Яшкир, B.A. Меркулов:  Ведомости Научного центра эк­спертизы средств медицинского применения 2012; (4):С. 4-10.

7.Лебедев, А. Т. Масс-спектрометрия в органической химии / Лебедев А. Т − М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. – 493с.

8.Моисеев, С.В. Использование метода ЯМР-спектроскопии для подтвер­ждения подлинности, идентификации и количественного определения посторонних примесей субстанции салициловой кислоты / С.В. Моисеев, В.И. Крылов, Т.В. Мастеркова, B.A. Яшкир, Н.Д.Бунятян: Ведомости Научного центра экспертизы средств ме­дицинского применения 2014; (1): С.15-19.

9.Преч, Э.Определение строения органических соединений / Преч Э., Бюльманн Ф., Аффольтер К. − М.: Мир, 2006. − 439с.

10.Поисковая база спектральных данных органических веществ (Spectral database for organic compounds, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Japan): Режим доступа:  http://riodb01.ibase.aist.go.jp (13.05.2019)

11.Сайт компаний Aldrich-Sigma: Режим доступа:  http://www.sigmaaldrich.com (13.05.2019)

12.Сильверстейн, Р. Спектрометрическая идентификация органических соединений / Сильверстейн Р., Вебетер Ф., Кимл Д. − М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. − 520 с.

13.Timothy Claridge, D. W., High Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry/ D. W. Timothy Claridge: Elsevier Ltd., (2009).-98p.

14.Tyvind, M.  Flavonoids. Chemistry, biochemistry and applications/ M. Tyvind, Andersen, R. Kennet Markham: Taylor & Francis Group, LLC (2006)-137p.

15.Tomati, U. NMR characterization of the polysaccharidic fraction from Lentinula edodes grown on olive mill waste waters/ Tomati U, Belardinelli M, Galli E, lorV, Capitani D, Mannina L, VielS, Segre A.  Carbohydr Res. 2004; 339(6): 1129-34p.