Дипломная работу на тему: «Изучение влияния препаратов AQUASHINE на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека».

Дипломная работу на тему: «Изучение влияния препаратов AQUASHINE на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека».

 

Аннотация

Дипломная работу на тему: «Изучение влияния препаратов AQUASHINE на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека».

Работа состоит из четырех частей: ВВЕДЕНИЕ, ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ, ЗАКЛЮЧЕНИЕ и СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ..

Во введении описаны актуальность, цель и основные задачи работы.

Первая глава состоящей из трех основной части  посвящена теоретическим аспектам исследования синтетических пептидов, как биологически активных соединений, а также методам синтеза, безопасности использования и их коммерческой значимости на рынке косметических средств. Во второй главе изложены причины выбора прямого иммунофлуоресцентного метода анализа и результаты проделанной работы. В третьей главе представлены характеристика объектов исследования и подробная методика с описанием всех этапов проведения эксперимента.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.. 2

ВВЕДЕНИЕ. 3

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ. 7

1. Литературный обзор: синтетические пептиды и их свойства. Биомаркеры старения. 7

1.1 Классификация и роль пептидов в организме. 7

1.2 Пептиды в косметике. 8

1.3 Синтез пептидов. 12

1.4 Оценка безопасности биологически активных пептидов, используемых в косметике. 18

1.5 Коммерческое производство и применение биоактивных пептидов. 19

1.6 Характеристика биологических маркеров старения. 21

2. Результаты работы и их обсуждение. Влияние линии препаратов Aquashine на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека. 24

2.1 Имунофлуоресцентный метод и его преимущества. 24

2.2 Влияние препаратов Aquashine, Aquashine BR, Aquashine BTX на экспрессию маркера TRF1 и кальретикулина в культуре фибробластов. 26

3. Экспериментальная часть. 34

3.1 Характеристика объектов исследования. 34

3.4 Окрашивание препаратов культуры фибробластов человека иммунофлуоресцентным методом. 43

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 46

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.. 48

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГК – гиалуроновая кислота

МФА – метод флуоресцирующих антител

нМФА – непрямой метод флуоресцирующих антител

пМФА – прямой метод флуоресцирующих антител

CALR – кальретикулин

DPBS – Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко

IF – иммунофлуоресцентный метод

МЕМ – Minimum Essential Medium. Разработана Гари Иглом и является наиболее распространенной средой для культивирования клеток.

М-199 - Среда используется для культивирования клеток животных и человека.  Написать конкретнее

PBS - Натрий-фосфатный буфер (англ. Phosphate buffered saline)

ВВЕДЕНИЕ

Старение кожи — это естественный процесс, вызванный как внутренними изменениями, так и внешними повреждениями [1,2].

Поэтому сегодня современные косметические продукты требуют высокоэффективных ингредиентов, которые способствуют замедлению и предотвращению процесса старения.

Последние 20 лет набирает популярность включение биоактивных ингредиентов в состав косметических средств, называемых «космецевтическими», чтобы обеспечить биологическую активность косметических средств местного действия. Хотя термин «космецевтика» юридически не выделен, он обычно используется для определения косметических продуктов с активными ингредиентами, способствующими подобным лекарствам преимуществам.

Идея использования пептидов основана на их способности участвовать во многих естественных процессах организма, таких как: модуляция пролиферации клеток, миграция клеток, воспаление, меланогенез и синтез белка Таким образом, было высказано предположение, что, возможно, сконструированные (биоактивные, синтетические, биомиметические) пептиды могли бы выполнять заданные функции [3].

Методы синтеза, изучения свойств биологических молекул, а также их молекулярных структур, были значительно расширены во второй половине прошлого века, что принесло ощутимые результаты и в последствии биомиметические пептиды были выделены как самостоятельные объекты исследования. Таким образом сформировались представления об их роли. 

Со временем были синтезированы пептиды с высокой биологической активностью, которые могли быть использованы в косметике, терапии и иммунологии, и даже нутрициологии. Сейчас пептиды в косметических средствах могут помочь в решении следующих проблем: уменьшить количество мимических морщин благодаря пептиду, который предотвращает напряжение лицевых мышц, улучшить состояние и внешний вид кожи за счет восстановления коллагена и эластина, отбелить кожу и уменьшить пигментацию, снять воспаление, увлажнить и повысить упругость кожи.

 Пептиды занимают около 10% объема продаж фармацевтических компаний (около 25 миллиардов долларов США), в то время как весь мировой рынок космецевтики (2017 г.) составил около 42,8 млрд. долларов США [4].

CAGR – общемировой годовой рост производства, составляет 9.1 % для биоактивных пептидов, что демонстрирует прирост постоянной нормы прибыли в период с 2016 по 2024 год.

Рисунок 1. Объём производства биоактивных пептидов [4]

Таким образом, обобщение научной информации по составу, свойствам и применению наиболее распространенных биоактивных пептидов, используемых в космецевтике, представляет интерес как с практической, так и с теоретической точки зрения.

Объект исследования – препараты Aquashine («Caregen Co., LTD», Южная Корея) – это линия для интенсивной ревитализации кожи в которые входят: AQUASHINE, AQUSHINE BR и AQUASHINE BTX.

Caregen Co., Ltd. (Аньян-си, Кёнгидо, Южная Корея) с 2002 года разработала биомиметические пептиды, основанные на обширных исследованиях факторов роста. Компания входит в ТОП-10 мировых производителей биомиметических пептидов. Используемый здесь термин «биомиметический пептид» относится к синтетическому агонисту природных факторов роста и полностью имитирует действие родительских молекул.

Биомиметические пептиды представляют собой олигопептиды, состоящие из 10-15 аминокислот, и способные обеспечить клинические преимущества, сходные с рекомбинантными факторами роста, снижать затраты и иметь большую химическую стабильность.  Технология двухслойной инкапсуляции компании Caregen улучшает проникновение активных ингредиентов в кожу и защищает молекулы от эндогенных протеаз, что обеспечивает более высокую эффективность.

Предмет исследования - изучение влияния и подтверждение эффективности препаратов с биомиметическими пептидами на состояние кожи.

Цель исследования - изучение влияния препаратов AQUASHINE, на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека.

Задачи исследования:

1.Проанализировать литературные источники.

2.Изучить антивозрастной эффект пептидов.

3.Изучить влияние препарата на культуру фибробластов кожи человека.

Теоретическая значимость работы заключается в том, что предпринята попытка расширить и углубить теоретические положения в области anti-age косметологии, связанной с применением биомиметических пептидов.

Практическая значимость. Научное обоснование использования биомиметических пептидов в области производства косметических и инъекционных препаратов. Доказательство эффективности включения синтетических пептидов, путём проведения экспериментальной работы.

Дипломная работа изложена на 56 страницах машинописного текста и состоит из списка использованных сокращений, введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 42 ссылок. Работа содержит 11 рисунков и 1 таблицу.

Результаты работы доложены на 71-ой внутривузовской научной студенческой конференции «Молодые ученые – инновационному развитию общества (МИР-2019)» в марте 2019г.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. Литературный обзор. Синтетические пептиды и их свойства. Биомаркеры старения.

1.1 Классификация и роль пептидов в организме

Пептиды, с химической точки зрения, представляют последовательность аминокислот, основным отличительным от белков признаком является количество фрагментов аминокислот в молекуле. Условно считают, что пептиды содержат в молекуле до 100 (что соответствует молекулярной массе до 10 тыс.), а белки - более 100 аминокислотных остатков (молекулярная масса от 10 тыс. до нескольких миллионов).

Некоторые из них обнаружены в организме человека и известны тем, что играют несколько биологических ролей. Пептиды регулируют разнообразные физиологические процессы, включая иммунитет, стресс, рост, гомеостаз и деление. 

В качестве примеров можно привести следующие пептиды, которые действуют при метаболизме клеток:

- Субстанция P находится в эпидермисе, это дипептид с 11 аминокислотами, который действует как мощный вазодилататор (сосудорасширяющее), способствующий балансу между дифференцировкой и обновлением клеток [5,6].

-  Пептиды соматостина (СОМ) и нейропептид Y, обнаруженные в коже (семейство эндокринных нейротрансмиттерных пептидов) играют роль в тонусе сосудов кожи, вызывая вазодилатацию (способствуют выделению гистамина) и вазоконстрикции соответственно;

- Адипоциты, присутствующие в гиподерме, способны высвобождать биоактивные пептиды, называемые адипоцитокины, такие как лептин, резистин [7];

- Инсулин можно считать примером полипептида, который действует на клеточный метаболизм, так как он облегчает поступление глюкозы внутрь клетки и взаимодействует с гепатоцитами, мышечными клетками, и адипоцитами [8].

1.2 Пептиды в косметике

При старении и при заболеваниях кожи количество регуляторных пептидов снижается, что приводит к ухудшению работы и обновления клеток и, как следствие, образованию различных дефектов кожи: морщин, рубцов, пигментных пятен, пониженного коэффициента увлажняющего фактора, снижение тонуса и т.д. Сохранение физиологической стабильности и структуры кожи может обеспечить введение факторов роста клеток и пептидов извне.

Существует три группы пептидов, используемых в косметической и дерматологической областях для замедления процесса старения: пептиды-блокаторы мышечного сокращения, пептиды-стабилизаторы, сигнальные пептиды [9].

Первые – пептиды блокаторы мышечного строения, являются безопасной заменой и альтернативой ботулотоксину косметологии. Такие пептиды блокируют передачу сигнала с нервного окончания на мышечное волокно.
Примером такого пептида является:

- Ацетил гексапептид, INCI name: Acetyl Hexapeptide-3 или - синтетический антивозрастной косметический ингредиент, который блокирует передачу нервных импульсов к мышце за счёт блокировки некоторых протеинов.

Молекулярный вес: 889.9 Da

Пептиды-стабилизаторы ответственны за транспортировку и стабилизацию, таких элементов как медь. Микроэлемент меди способствует заживлению ран, также является кофактором для ферментов, необходимых для синтеза коллагена, супероксиддисмутаза (антиоксидантного фермента) и процесса меланогенеза.

 В организме человеке содержится медьсодержащий пептид Cu-GHK, который является важным регулятором в процессе регенерации многих тканей [10]. Присутствует в плазме крови, слюне.

Трипептид GHK и его комплекс с медью

Наиболее популярные в космецевтике - сигнальные пептиды. Они могут действовать как факторы роста (естественные белковые молекулы), так как они активируют протеинкиназу С, являющеюся основным фактором, ответственным за рост и миграцию клеток. Сигнальные пептиды действуют как мессенджеры, которые запускают синтез коллагена фибробластами. Это увеличение выработки коллагена, по-видимому, приводит к более упругой и молодой коже. Благодаря исследованиям по заживлению ран и выработке коллагена фибробластами, исследователи обнаружили группу пептидов, которые играют активную роль в активации клеточных сигналов этих процессов.

Сигнальные пептиды имеют структуру, которая может быть разделена на три домена (элемента третичной структуры белка):

- положительно заряженный аминоконцевой домен (область n, 1-5 длинных остатков); 

- гидрофобный центральный домен (область h, 7–15 остатков); 

- и полярный карбоксильный концевой домен (область c, 3–7 остатков)

Рисунок 2. Доменная структура сигнального пептида [9]

Примеры сигнальных пептидов, которые применяют в составах космецевтических и косметических средств:

- Олигопептид-68, INCI name: Oligopeptide-68 (β-WHITE™) — это псинтетический пептид, содержащий 8 аминокислот, состоящий из: аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, изолейцина, глицина, глутамина, изолейцина, серина, треонина, триптофана, и тирозина. Он используется в косметике в качестве отбеливающего ингредиента. Молекулярная масса: 1 251,4 Da

         - Ацетилгексапептид-8, INCI name: Acetyl hexapeptide-8- пептид, противодействующий морщинам. Является синтетическим продуктом, и считается высокоэффективным средством. Представляет собой точную копию N-терминального конца SNAP-25. Чаще всего применяется в комплексах с другими факторами роста Молекулярная масса: 889 Da.

         Основным барьером для препаратов накожного применения является роговой слой, самый верхний слой эпидермиса. Одним из известных способов преодоления этого барьера является применение химических энхансеров, который может быть применен и для доставки пептида [11]. Для улучшения проникновения в кожу водорастворимых соединений, используют также метод модификации пептида, заключающийся в ацетилировании или во введении в состав молекулы гидрофобных групп. Получаемая таким образом сложная молекула, состоящая из белковой и липидной частей, лучше проникает через липидный барьер, где ферменты внутренних слоев кожи высвобождают белковый фрагмент, отделяя его от липидной части.

Результат действия сигнальных пептидов был доказан клиническими исследованиям компании Caregen:

•                    нормализация деления клеток эпидермиса и дермы;

•                    восстановление «работоспособности» и кооперации клеток;

•                    увеличение синтеза собственного коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты

•                    защита ДНК клеток от повреждения свободными радикалами;

•                    профилактика УФ-старения, предотвращение развития меланомы, воспалительных, аллергических, аутоиммунных заболеваний кожи

•                    восстановление регенераторных и защитных свойств кожи;

•                    нормализация липидного обмена;

•                    нормализация синтеза меланина;

•                    нормализация синтеза кожного сала;

•                    восстановление роста волос;

         Пептидная терапия решает эстетические задачи:

•                    омоложение кожи (разглаживание морщин, улучшение рельефа и цвета кожи, повышение ее уровня увлажненности, эластичности и упругости, обеспечение быстрой регенерации кожи, лифтинг);

•                    осветление пигментации любого происхождения;

•                    устранение синевы и темных кругов под глазами;

•                    устранение мешков под глазами;

•                    лечение и омоложение волос (остановка выпадения волос у мужчин и женщин, увеличение количества волос в стадии роста и уменьшение количества волос в стадии выпадения, восстановление цвета, блеска и качества волос);

•                    лечение целлюлита, липолиз (уменьшение объёма жировых отложений, улучшение дренажа лимфы, коррекция овала лица и силуэта тела);

      

1.3 Синтез пептидов

Исследование химического синтеза было впервые начато более 30 лет назад. Однако лишь недавно этот процесс стал более доступным, благодаря использованию реагентов быстрого связывания, а также минимизации побочных реакций [12]. Главными аспектами химического синтеза являются защита и активация. Стадия защиты предназначена для обеспечения химической селективности, необходимой для конструирования конкретной пептидной последовательности. Активация относится к химическому связыванию, необходимому для обеспечения количественного образования каждой пептидной связи в последовательности [13].

В химическом синтезе используются реагенты для активации карбоксильной группы аминокислоты, которая будет отдавать ацильную группу для образования пептидной связи. Образование пептидной связи обусловлено нуклеофильной атакой α-аминогруппы карбоксильной группой другой аминокислоты. В этом синтезе реакционноспособные функциональные группы, которые непосредственно не участвуют в образовании пептидной связи, получают предварительную защиту [14]. Примеры методов защиты будут приведены ниже.

На сегодняшний день для синтеза пептидов используются методы комбинаторной химии, позволяющие использовать различные процессы для быстрого и одновременного синтеза большого числа соединений (комбинаторных библиотек) и впоследствии для определения их потенциальной пользы. Такой метод работы все чаще встречается в фармацевтической промышленности, поскольку он позволяет быстро идентифицировать и выделить активные молекулы [15].

Существует две разновидности химического синтеза пептидов: синтез в растворе (классический синтез) и синтез на твердой фазе. Классический синтез осуществляется последовательным присоединением аминокислот от С-конца к N-концу цепи.

Твердофазный синтез является процедурой получения пептидов в больших количествах на твердой подложке, которая остаётся нерастворимой в реакционной среде. Твердофазный синтез заключается в синтезе пептида с заранее установленной последовательностью, который всё время остается связанным с твердой подложкой. Эта подложка представляет собой нерастворимый полимер, содержащий внутри себя колонки, подобные хроматографическим. Эти функциональные группы, позволяют образовывать стабильные связи с реагентом, используемым для снятия защиты с N-аминогруппы.

Синтез пептидов в твердой фазе главным образом заключается в ацилировании аминокислоты, связанной с нерастворимым носителем (смолой) через линкер. 

После чего защита концевой аминогруппы удаляется (стадия снятия защиты), чтобы позволить следующей аминокислоте последовательности присоединиться к комплексу «пептид-линкер-смола». Цикл снятия защиты и присоединения повторяется до тех пор, пока желаемая последовательность не завершена. В конце для разрушения комплекса «пептид-линкер-подложка» используется специальный реагент, который также удаляет защитные группы боковых цепей, устойчивых к незащищенным условиям концевой аминогруппы.

Рисунок 3. Схема синтеза пептидов на твердой фазе [13]

Для химического синтеза пептидов можно использовать два метода защиты: Boc (трет-бутоксикарбонильная защита) и Fmoc (9H) (флуоренилметоксикарбонильная защита), названные в соответствии с типом защиты аминогруппы кислоты, участвующей в синтезе.

В первом случае используется трет-бутоксикарбонильная защита аминогруппы.  Этот метод основан на различиях в чувствительности к действию кислот. Таким образом, Boc-группа обычно удаляется с помощью трифторуксусной кислоты, когда защитные группы боковых цепей (сложные эфиры, эфиры и уретановые производные на основе бензилового спирта) специально предназначены для обеспечения устойчивости к повторным циклам удаления Boc-группы и удаляются сами только специальными реагентами, относительно более сильной кислотой (обычно плавиковой

кислотой).

Этот метод позволяет синтезировать пептиды, содержащие до ста аминокислот. Так достигается наибольшая чистота продукта и совершенствуется автоматизация. Например, твердофазный синтез пептидов дает возможность синтезировать гексапептид, способный имитировать часть белка SNAP-25 и конкурировать с ним, создавая комплексы. Местное применение такого конкурирующего пептида дает возможность сократить образование мимических морщин, путем уменьшения процесса сокращения мышц обратимым и контролируемым образом.

Во втором методе используется 9H-флуоренилметоксикарбонильная защита (Fmoc) N-аминогрупп.  В этом случае обеспечивается большая химическая селективность, чем в первом, так как Fmoc-защита удаляется в щелочной среде (пиперидин в N-метилпирролидоне или диметилформамиде) без изменения боковых цепей чувствительных к кислоте.

Защитные группы боковых цепей совместимы с защитной группой Fmoc. В основном это эфирные, эфирные и уретановые производные на основе трет-бутанола. Защитные группы боковых цепей удаляют к концу синтеза с использованием трифторуксусной кислоты.

Ферментативный синтез. В этом методе формирование пептидной связи запускается ферментом (протеазой) в свободной или иммобилизованной форме (связанной с твёрдым носителем) [16]. Этот метод особенно эффективен для синтеза очень коротких пептидов (2-5 аминокислотных остатков) и для конденсации больших пептидных фрагментов [17].

Протеолитические ферменты, такие как химотрипсин, папаин, пепсин, субтилизин, термолизин, трипсин использовались в присутствии органических растворителей в качестве катализаторов для синтеза пептидных связей [18].

Ферментативный синтез пептидов имеет ряд преимуществ перед химическим методом, например, хорошую стереоселективность. Основным практическим недостатком к применению протеазы для образования пептидной связи является подбор подходящих условий, позволяющих образовывать связь без вторичного гидролиза пептида или пептидных фрагментов, используемых в качестве реагентов.

Формирование пептидной связи путем ферментативного катализа может происходить по нескольким механизмам, включающим обратную реакцию гидролиза пептидов и транспептидацию (разрыв пептидной связи и образование новой). Подбирают такие условия реакции, чтобы сместить ее равновесие в сторону образования пептидной связи.

Рисунок 4. Ферментативный синтез пептидов по реакции обратного гидролиза [13]

Транспептидация происходит в результате разрыва пептидной связи с образованием активного ацил-ферментного интермедиата.  Этот интермедиат подвергается атаке в присутствии нуклеофила (пептид или аминокислота блокированы по α-карбоксильной группе) и, следовательно, вызывает образование новой пептидной связи.

Рисунок 5. Ферментативный синтез пептидов по механизму транспептидации [13]

В обоих механизмах равновесие должно быть смещено в сторону реакции синтеза, что требует использования защиты α-амино и карбоксил субстрата, добавления органического растворителя в среду реакции, избытка субстрата и удаления продуктов из реакционной среды.

Синтез на основе технологии рекомбинантных ДНК. Данный метод использует современные методы клонирования и экспрессии генов в микроорганизмах, что позволяет производить рекомбинантный пептид или несколько пептидов одновременно.

Обычно используются бактерии как систему экспрессии, причем E.coli (кишечная палочка) используется наиболее часто. Поскольку антимикробные пептиды обладают природной деструктивной активностью в отношении хозяина и относительной чувствительностью к протеолитической деградации, пептиды часто экспрессируются в виде слитых белков, чтобы повысить уровни их экспрессии [19]. Huang et al. [20] обнаружили, что гидролизованный субтилизином белок мышц стопы улитки Achatina fulica имеет большее количество низкомолекулярных пептидов, чем образцы, гидролизованные папаином и трипсином.

По сравнению с выделением из природных источников и другими методами синтеза, рекомбинантный подход предлагает наиболее экономически эффективную альтернативу для крупномасштабного производства пептидов [21].

Процесс меланогенеза или синтез меланинового пигмента происходит в органеллах меланоцитов, называемых меланосомами. Меланогенез регулируется ультрафиолетовым светом, наследственными факторами и гормональной стимуляцией. Альфа-меланотрофин, гормон, состоящий из 13 аминокислотных остатков, ответственен за стимуляцию синтеза меланосом, который ускоряет их передачу в кератиноциты. Инъекции этого гормона делает кожу более загорелой слабо пигментированных людей. Биомиметический гексапептид, синтезированный на основе этого гормона, при местном применении может стимулировать меланогенез и загар кожи без гормональных эффектов.

Были синтезированы биомиметические молекулы белков, наиболее распространенных во внеклеточном матриксе: коллагена и ламинина. Замедление синтеза этих двух протеинов является одной из основных причин потери упругости кожи и появления морщин. Разработки по содействию синтезу этих белков имеет основополагающее значение для борьбы со старением. В первом случае было выявлено, что синтетические пентапептид, соответствующий микрофрагменту коллагена, активирует синтез коллагена, фибронектина и других компонентов внеклеточного матрикса в фибробластах. Исследования ex vivo и in vitro, а также in vivo измерения поверхности, объема, плотности и глубины морщин демонстрируют улучшения рельефа кожи, которое достигается местным применением, что подтверждает действие пептида.

Ламинин представляет собой гликопротеин, состоящий из трех пептидных цепей, названных альфа, бета и гамма, соединенных дисульфидными связями. Ламинин и интегрины (рецепторы, отвечающие за взаимодействия во внеклеточном матриксе) участвуют в процессах клеточной адгезии и ангиогенеза, обеспечивая правильность процессов питания, клеточной оксигенации. Поэтому был получен гексапептид, находящийся в альфа-цепи ламинина, который усиливает синтез ламинина и интегринов в фибробластах, что улучшает адгезию, миграцию, пролиферацию и питание клеток кожи.

1.4 Оценка безопасности биологически активных пептидов, используемых в косметике

Согласно FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами, США), до 2012 года пальмитоил-подобные пептиды были тщательно протестированы в отношении их безопасности, так как они широко используются в косметическом производстве [22].

В настоящее время существует более 60 пептидов, одобренных управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA). Ожидается, что количество пептидных препаратов значительно вырастет: около 140 препаратов в настоящее время проходят клинические испытания и более 500 терапевтических пептидов находятся на стадии доклинической разработки. Обзор был представлен в недавнем исследовании Каспара и Райхерта [23]

В 2014 году учёным Майей Кампос был изучен биоактивный ацетилгексапептид-3. Оценка безопасности была проведена с использованием патч-теста, который позволяет установить причинный фактор в развитии поражения кожи [24].

Гипоаллергенная клейкая лента (площадь 50 мм²) применяется один раз на спинной области 27 добровольцев (в возрасте от 20 до 59 лет) фототипов II (светлокожий европейский) и IV (средиземноморский). Через 48 ч ленту удаляли и проводили визуальную оценку результата.

Другая исследовательская группа - Бланес-Мира (2002), продемонстрировала с помощью данного теста, что биологически активный ацетилгексапептид-3 безопасен для использования, так как никаких негативных реакций не было выявлено [25].

Эффективность и безопасность bcgj пептиды GHK-Cu в составе крема были исследованы в следующем эксперименте: в течение 4-х недель в периорбитальной зоне сорок женщин-добровольцев с сильным фотоповреждением наносили данный крем на кожу. Было отмечено значительное улучшение параметров, включая тонкие линии, морщины и общий вид век [26].

1.5 Коммерческое производство и применение биоактивных пептидов

Биоактивные пептиды представляют большой интерес для различных продуктов, связанных со здоровьем человека [27]. Недавние достижения в сочетании с традиционными преимуществами пептидов (высокая биологическая активность, высокая специфичность и низкая токсичность) побудили фармацевтические компании вновь сосредоточить свое внимание на агентах на основе пептидов [28].  Ожидается, что мировой рынок пептидной терапии значительно вырастет в течение прогнозируемого периода [4]. Пептиды образуют важный сегмент, учитывая их естественную доступность, селективный способ действия и низкую частоту побочных эффектов [29].

Основные производства и научные лаборатории, находятся в Северной Америке. United Peptide Inc, Advanced Peptides, Inc., Phoenix Peptides – расположены в США. CanPeptide -канадская компания, лидер в своём сегменте, стремится удовлетворить потребности в синтетических пептидах, независимо от цели: академические исследования или биофармацевтическое производство. Объединяя обширный опыт в синтезе нестандартных пептидов и аналитической химии, наши ученые используют различные запатентованные химические процессы, чтобы обеспечить наших клиентов по всему миру высококачественными пептидами в короткие сроки и по очень конкурентоспособной цене. CanPeptide использует автоматический, полуавтоматический твёрдофазный синтез, чтобы предложить как небольшой, так и крупномасштабный объём производства в диапазоне от миллиграмм и мультиграмм.

На территории Российской Федерации расположены компании, которые производят пептиды. Их основной целью является замещение импортного сырья и развитие пептидной промышленности на территории России. Например, компания ООО "ТД Пептид Био". Основная деятельность - разработка синтезированных пептидов цитогенов и научные исследования в области геронтологии и anti-age медицины на базе ООО «Эксесс Байосаинс» совместно с Санкт-Петербуржским институтом биорегуляции и геронтологии СЗФО РАМН (директор – Хавинсон В.Х.)

Другая научно-исследовательская и производственная компания ООО «Рашн Пептаид» работает с 2016 года, специализируется в области разработки способов получения и последующей наработки субстанций пептидной природы. Пептидная продукция используется для проведения биологических исследований in vitro, изучения активности, стабильности, и для других физических и химических опытов и процессов.

Надзор за производственным процессом пептидных биорегуляторов осуществляется Санкт-Петербургским институтом биорегуляции и геронтологии СЗФО РАМН. Самим производством занимается ООО «ХБО при РАН «Фирма Вита».

Концерн Caregen (Корея) производит более 70 биомиметических пептидов и 20 факторов роста, которые прошли регистрацию РСРС (Personal Care and Products Council), а также ISO 9001(«Системы менеджмента качества»), ISO 1400 («Системы экологического менеджмента — спецификация и руководство по использованию»), что подтверждает высокие стандарты производства и безопасности препаратов. Продукция Caregen запатентована и используются на косметическом рынке Европы, США, Японии, Южной Кореи, Китая и других стран.

Инъекционные препараты в большинстве своём производятся зарубежом. В Корее производят Dermaheal–препарат для мезотерапий. Мезотерапевтический коктейль Mesoeye С71 (Мезоай) –  включает в себя пептиды для кожи вокруг глаз, производится компанией BNC Korea.  Inc.Meso-Wharton - инъекционный препарат нового поколения с высокой степенью эффективности за счет глубокой репарации тканей на уровне клеток. Разработан компанией ABG Lab LLC (США) и производится на фармацевтическом предприятии в Южной Корее.

Во многих странах мира пептиды используются в качестве косметического компонентов кремов для наружного применения. Так в России, компания «Эвалар» выпускает крем «Лора» с антивозрастным эффектом. В его состав входят пальмитоил трипептид-5. Также в России популярна косметика от «Faberlic» и ее линейка пептидных кремов Sengara.

Французская компания «L’Oreal» производит крем «Возраст Эксперт 45», где используется формула с ретинопептидами, которые ускоряют процессы регенерации во всех слоях эпидермиса.  Комплекс-сыворотка для лица "h" Serum, 3LAB, основная задача которой — ускорение синтеза белков в клетках кожи и поддержание водного баланса. За это отвечают пептиды Promatrix и Nano-Claire GY™, антиоксиданты и гиалуроновая кислота. Крем для век Cold Plasma Plus Eye Cream, Perricone MD. В составе — высокая концентрация витамина С в стабильной форме, гиалуроновая кислота, N-Hydroxysuccinimide (осветляющее вещество), а также пептиды меди. Сыворотка «Божественная гармония» от L’Occitane – является составляющим целого комплекса по уходу за зрелой кожей. Сыворотка содержит пальмитоил олигопептид и пальмитоил тетрапептид-7 — сигнальные пептиды, которые стимулируют клетки кожи вырабатывать больше коллагена и эластина, что способствуют укреплению контуров лица и повышению общего тонуса кожи.

География производства и применения пептидов весьма обширна, потому что за последние 15 лет был сделан колоссальный прорыв в изучении их свойств. Очень многие ведущие производители косметики и космецевтики используют биоактивные пептиды в составе своих продуктов, выше приведена лишь малая часть производителей.

1.6 Характеристика биологических маркеров старения

Выявление биомаркеров старения облегчает дифференциацию хронологического возраста людей, имеющих разные скорости старения. Количественные биомаркеры старения могут также определять степень «здорового старения» и прогнозировать состояние и здоровье в дальнейшем.

Теломеры – биомаркеры, которые представляют собой рибонуклеопротеиновые комплексы на конце хромосом и становятся короче после каждой репликации, так как теломераза, фермент, ответственный за ее репликацию, не экспрессируется в соматических клетках регулярно [30]. Теломеры – концевые участки хромосом, которые обеспечивают геномную стабильность и характеризуются отсутствием способности к соединению с другими хромосомами или их фрагментами. В клетках млекопитающих, они образованы длинными двуцепочечными повторами гексануклеотидов TTAGGG. Теломеры млекопитающих защищены от механизмов репарации ДНК комплексом из шести белков, названных шелтерином (телосомой). Шелтерин состоит из шести субъединиц: TRF1, TRF2, POT1, Rap1, TIN2 и TPP1.Потеря одного из компонентов комплекса защиты оказывает негативное воздействие на функцию и стабильность теломер. При старении эндотелиальных клеток было показано уменьшение содержания TERF-1. Гиперэкспрессия TERF-1, вызванная в стареющих эндотелиальных клетках, вызывала снижение количества теломер-ассоциированных фокусов повреждения ДНК.

Недостаток или отсутствие TERF1 в клетках приводит к повреждению ДНК и клеточному старению. Предполагается, что возраст-ассоциированное снижение содержания TERF-1 приводит к серьезным дефектам на более поздних стадиях старения, таким как повреждения теломер и дисфункция хромосом [31].

Другой биомаркер, кальретикулин (CALR) - многофункциональный кальций-связывающий белок, участвующий в различных физических и патологических процессах.  Преимущественно CALR расположен в эндоплазматическом ретикулуме, а также в цитоплазме и клеточной мембране. Эта молекула, массой 46 kDa, была впервые идентифицирована как Са²⁺-связывающий белок в саркоплазматическом ретикулуме мышечных клеток. Кальретикулин по отношению к связыванию кальция подразделяют на две категории. Одна часть может связывать кальций даже при очень низких концентрациях. Другая часть имеет меньшую связываемость, но очень высокую емкость и может связывать несколько ионов кальция одновременно.

 Ген CALR расположен на коротком плече 19 хромосомы и состоит из 9 экзонов (участков ДНК, копии которых составляют зрелую РНК), и предаставляет собой три домена: N-домена, Р-домена и С-домена [32].

Рисунок 6. Структура кальретикулина

N-домен – домен глобулярного строения, содержащий остатки цистеина, которые образуют дисульфидные связи, посредством которых N-домен взаимодействует с Р-доменом для создания шаперонной функции, то есть способствует нормальному образованию структуры CALR. Богатый пролином P-домен содержит два набора трех повторяющихся регионов. Эти повторяющиеся последовательности аминокислот образуют шаперонную структуру, которая отвечает за сворачивание белков. Кислый С-домен CALR имеет очень важное значение для присоединения Ca²⁺, что играет важную роль во взаимодействии с другими белками шаперонами в эндоплазматическом ретикулуме (структура внутри клетки).

К двум основным функциям кальретикулина внутри ЭР относят регулирование кальциевого гомеостаза и шаперонную функцию. Кроме того, существующие исследования показывают, что CALR, находящийся не на ЭР, регулирует важные биологические функции, в том числе адгезию клеток, экспрессию гена и стабильность рибонуклеиновой кислоты (РНК).

Снижение с возрастом содержания кальретикулина приводит к снижению контроля качества белка, что приводит к деструктивным изменениям в процессе старения [33].

Местное применение кальретикулина улучшает заживление кожных ран на животных моделях. В ранах, обработанных кальретикулином, увеличивалась скорость эпителизации мигрирующими кератиноцитами и наблюдалась сильная индукция грануляционной ткани (неодермис), синтезируемой фибробластами.

2. Результаты работы и их обсуждение. Влияние линии препаратов Aquashine на экспрессию маркеров в фибробластах кожи человека.

2.1 Имунофлуоресцентный метод и его преимущества

Эксперимент был проведён методом непрямого имунофлуоресцентного анализа, который основан на визуальном учёте антител с гомологичным антигеном. Это один из самых простых и быстрых методов иммуногистохимии. Методы иммунофлуоресценции (IF) или визуализации клеток основаны на использовании антител для маркировки специфического целевого антигена флуоресцентным красителем (также называемым

флуорофоры или флуорохромы).  Наиболее часто используемыми флуорохромами являются флуоресцеин или FITC, родамин, фикоэритрин (РЕ), Dylight, Texas Red. В данной работе было отдано предпочетение Alexa Fluor, которые использовались в данной работе.

Семейство Alexa охватывает широкий спектр длин волн возбуждения и излучения от видимого до инфракрасного света и классифицируется в соответствии с их максимумами возбуждения (таблица 1).

Таблица 1: Информация об особенностях красителей Alexa от Thermo Fisher Scientific.

название	Поглощение (λ / нм)	Эмиссия (λ / нм)	цвет
Alexa Fluor 350	346	442	синий
Alexa Fluor 405	401	421	синий
Alexa Fluor 430	433	541	Желто-зеленый
Алекса Флуор 488	496	519	зеленый
Alexa Fluor 532	532	553	желтый
Alexa Fluor 546	556	573	оранжевый
Alexa Fluor 555	555	565	оранжевый
Alexa Fluor 568	578	603	Оранжево-красный
Alexa Fluor 594	590	617	красный
Alexa Fluor 610	612	628	красный
Alexa Fluor 633	632	647	Далеко-красный
Alexa Fluor 635	633	647	Далеко-красный
Alexa Fluor 647	650	665	Ближний ИК
Alexa Fluor 660	663	690	Ближний ИК
Alexa Fluor 680	+679	702	Ближний ИК
Alexa Fluor 700	702	+723	Ближний ИК
Alexa Fluor 750	+749	775	Ближний ИК
Alexa Fluor 790	+784	814	Ближний ИК

Хотя их химическая структура красителей не опубликована, Alexa Fluor обычно синтезируются путем сульфирования таких красителей, как флуоресцеин, цианин, кумарин и родамин. Это сульфирование делает красители Alexa отрицательно заряженными и гидрофильными.

Эмиссия от красителей Alexa может быть обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии. Как вы можете видеть на рисунке, этот диапазон красителей обеспечивает впечатляющий диапазон длин волн излучения.

Рисунок Данные спектров эмиссии красителей Alexa, [Thermo Fisher Scientific]

Красители Alexa представляют собой серьезную разработку в области применения флуоресценции, поскольку они обладают многими преимуществами. Alexa Fluor демонстрируют большую яркость, относительно других спектрально подобных конъюгатов. Поэтому они требуют меньшего общего количества образцов в экспериментах, позволяя обнаруживать мишени с низким содержанием. Конъюгаты Alexa Fluor обладают большей фотостабильностью, чем другие, что дает больше времени для захвата изображений.

Возвращаясь к методке, существует два способа проведенияIF в зависимости от того, конъюгирован ли флуорофор с первичным или вторичным антителом:

·        Прямой метод использует одно антитело, направленное против интересующей мишени. Первичное антитело непосредственно конъюгировано с флуорофором;

·        Непрямой (косвенный) использует два антитела. Первичное антитело является неконъюгированным и флуорофоры-конъюгированного вторичного антитела, направлены против первичного антитела, таким образом происходит обнаружение мишени.

В данной работе было отдано предпочтение непрямому методу несмотря на то, что меньшее количество шагов в протоколе упрощает выполнение анализа. Сигнал, полученный прямым методом, может показаться слабым по сравнению с косвенным, поскольку усиление сигнала, обеспечиваемое использованием вторичных антител, не происходит.

Выбор нМФА основан на высокой чувствительности и точности. Под высокой чувствительностью понимается возможность распознавания искомое даже при его небольшом содержании в образце.

Одним из преимуществ перед прямым методом является отсутствие необходимости иметь большой набор специфических флуоресцирующих антител, так как сама методика основана на использовании антиглобулиновых (антивидовых) антител, меченных флуорохромом.

Относительно других методик, данный нМФА имеет следующие преимущества: простота, небольшой расход реагентов, экономическая целесообразность, выраженная в доступности необходимых препаратов. Однако, необходимо учитывать такие недостатки, как необходимость специального оборудования. В анализе используется дорогостоящий флуоресцентный микроскоп, оборудованный соответствующим программным обеспечением.

Связывание молекул обнаруживают путем инкубации образца со вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором. Это обеспечивает видимый сигнал, который наблюдается с помощью флуоресцентного микроскопа.

2.2 Влияние препаратов Aquashine, Aquashine BR, Aquashine BTX на экспрессию маркера TRF1 и кальретикулина в культуре фибробластов.

Изучив и проанализировав научную литературу, был сделан вывод, что дефицит TRF1 вызывает распечатывание теломеры, что сигнализирует о повреждении участка ДНК, старению или апоптозу.

В исследовании [34] (Derevyanko A, Whittemore K) было доказано, что благодаря активации экспрессии TERF1 можно отсрочить возрастные паталогии. Уровень содержания TERF1 снижается при пассировании клеток in vitro.  Стоит отметить, что сверхэкспрессия TERF1 в этих клетках снижает урон ДНК и замедляет старение. [31]

Ниже, приведено краткое описание всех трёх объектов данного исследования. Для дальнейшего удобства, было принято решение обозначать их по принципу объект – номер.

Объект исследования №1: препарат Aquashine характеризуется своим базовым составом, по отношению к остальным представителям данной линии. Именно разработка данного биоревитализанта стала колоссальным прорывом в области инъекционной косметологии, так как подкожное введение синтетических пептидов, «запрограммированных» на выполнение определённых задач вызвало значительный прогресс в регенерации тканей.

Далее, продемонстрированы результаты лабораторного эксперимента, который доказывает положительное влияние препарата Aquashine на экспрессию TERF1.

Объект исследования №2: препарат Aquashine BR. Данный продукт, также предназначенный для подкожного введения, главная цель которого устранение пигментации кожи, выравнивание тона и придание здоровго внешнего вида.

  Состав  схож с составом с образцом №1, но его пептидный комплекс был усовершенствован, добавлением двух новых ингредиентов:

•        олигопептид-51 (CG-purilux);

•        декапептид-23 (CG-flatin).

Использование в составе продукта CG-purilux придаёт препарату отличительное свойство: этот пептид блокирует связь с рецептором меланина, благодаря чему оказывается мощное депигментирующее действие.

Следующая пара фотографий с конфокального микроскопа демонстрирует значительное увеличение экспрессии TERF1, что свидетельствует о эффективности данного препарата.

Объект исследования №3: препарат Aquashine BТХ. Этот препарат является самым модифицированным из всех трёх образцов, присутствующих в данной работе. Его отличительная особенность – два новых пептида:

•  декапептид-29;
• олигопептид-62;

Именно эти два компонента отвечают за выравнивание кожного рельефа и повышают элестичность дермы, таким образом оказывая лифтинг эффект. Так как  все условия во время проведения эксперимента с образцами №1, 2, 3  были сохранены для сравнительного анализа.

Выбрав методику и приступив к выполнению экспериментальной части, было принято решение, что каждый из представленных образцов препарата будет вводиться, начиная с 1 пассажа (доза – 2,0 мл препарата развести физиологическим раствором до 10,0мл) до 7-ого пассажа, так как именно седьмой пассаж соответствует увядающей коже человека.

Работа проводилась в несколько этапов:

1.Выделение фибробластов из доставленного в лабораторию образца кожи человека;

2. Пассирование полученной культуры клеток;

3. Окрашивание иммунофлуоресцентным методом;

4. Морфометрический анализ.

5. Статистическая обработка

Морфометрический анализ был проведён на конфокальном микроскопе Olympus FluoView 1000 (Япония) с использованием программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.2. 

Результаты первого опыта:

Рисунок 7. Экспрессия TERF-1 в культуре клеток фибробластов,

А – контроль, Б – при введении препарата Aquashine plus; В – при введении препарата Aquashine BR plus, Г – введении препарата Aquashine BTX plus.

При статистической обработке полученных результатов было установлено, что значения относительной площади экспрессии маркера в контрольной группе достоверно ниже, чем в группе с введением пептидных препаратов. На следующей странице приведена сравнительная гистограмма.

Рисунок 8. Сравнение показателей относительной площади экспрессии TERF-1 в культуре клеток фибробластов в контрольной группе и при воздействии препаратов Aqushine.

Результаты второго опыта:

Рисунок 9. Экспрессия кальретикулина в культуре клеток фибробластов,

А – контроль, Б – при введении препарата Aquashine plus; В – при введении препарата Aquashine BR plus, Г – введении препарата Aquashine BTX plus.

На гистограмме приведено сравнение показателей относительной площади экспрессии маркера Calreticulin в контроле и при воздействии препарата.

Рисунок 10. Сравнение показателей относительной площади экспрессии Calreticulin в культуре клеток фибробластов в контрольной группе и при воздействии пептидных препаратов.

Площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер.

Статистическая обработка проводилась в программе «Excel 2007. Microsoft Office» и в аналитической программе "Statistica 7.0".

Статистическая обработка всех экспериментальных данных включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро–Уилка (W-test).

Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускалла–Уоллиса).

Для выборок, где разброс был значительным, применяли процедуры множественных сравнений с помощью критерия Манна–Уитни. Для групп с незначительным разбросом применяли t-критерий Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,01.

В первую очередь работа была направлена на расширение доказательной базы эффективности применения пептидных препаратов. Это было сделано из необходимости продемонстрировать обоснованность использования данных препаратов при возникновении кожных дефектов. 

Под воздействием препаратов Aquashine, Aquashine BR, Aquashine BTX в культуре клеток фибробластов наблюдалась активация экспрессии TЕRF-1, что способствует стабильности теломеров и замедляет апоптозную фрагментацию. Апоптоз представляет собой генетически запрограммированную смерть клеток. Несмотря на то, что этот процесс неизбежный, пролонгация жизни клетки несёт в себе положительный эффект.

Также было показано увеличение площади экспрессии кальретикулина в фибробластах, что свидетельствует об усилении внутриклеточного синтеза белков. Это способствует повышению количества жизнеспособных клеток.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии у всех трёх препаратов выраженных геропротекторных и регуляторных свойств по отношению к фибробластам кожи. Модуляция активности генетического аппарата переводит клетку в режим оптимальной работы, что означает поддержание здорового гомеостаза и метаболизма.

Основываясь на результатах проведённого нами эксперимента, можно заключить что при воздействии препаратов Aquashine, Aquashine BR, Aquashine BTX происходит положительная физиологическая активность на клеточном уровне, что даёт нам возможность оценить эффективность действия препарата и подтвердить заявленные характеристики

3. Экспериментальная часть

3.1 Характеристика объектов исследования

Объектами данного исследования являются препараты линии Aquashine, предназначенные для подкожного введения. Всего в работе использовались три представителя данной линии: Aquashine, Aquashine Br, Aquashine BTX.

Aquashine – первый из препаратов данной серии, разработанный компанией Caregen (Korea).  Предназначен для подкожного введения в возрасте от 35 лет с целью исправления внешних деффектов кожи. В его состав входят следующие компоненты:

·        Октапептид-11 (CG-Seperin);

·        Нонапептид-18 (CG-Formade);

·        Олигопептид-34 (CG-TGP2);

·        Олигопептид-24 (CG-EDP3);

·        Олигопептид-72 (CG-boostrin);

·        Ацетил декапептид-3 (Rejuline);

·        Гиалуроновая кислота 1,5% (15 мг/мл);

·        24 аминокислоты;

·        14 витаминов (A, B6, E, B1, B7, B8, B2, K, I, B3, B12, B9, B5, C);

·        8 минералов и коэнзимов;

·        нуклеиновые кислоты;

·        антиоксиданты.

Aquashine BR – следующее поколение инъекционных препаратов, предназначенных для биоревитализации кожи с целью придать сияния (BR – bright, англ. сиять). Предназначен для использования в возрасте от 45 лет, когда кроме возникновения морщин возникает проблема возрастной пигментации. Комплекс пептидов и ГК, входящие в препарат, обеспечивают не только выраженный мягких тканей, но и заметное депигментирующее действие за счет снижения синтеза меланина.

 Состав препарата:

• Октапептид-11 (CG-Seperin);
• Нонапептид-18 (CG-Formade);
• Олигопептид-34 (CG-TGP2);

·         Олигопептид-72 (CG-boostrin)

• Олигопептид-51 (CG-Purilux);
• Декапептид-23 (CG-Flatin);
• Гиалуроновая кислота 1,5% (15 мг/мл);
• Аналогичный состав витаминов, минералов, нуклеиновых кислот и антиоксидантов.

Aquashine BTX – новейший из препаратов в данном исследовании. Обновленная формула с антивозрастными пептидными компонентами, снижающими мышечную активность при мимике. По действию схож с ботоксом, поэтому в названии зашифрована аббревиатура BTX. Рекомендован к применению для пациентов от 35 лет. Состав:

• Октапептид-11 (CG-Seperin);
• Нонапептид-18 (CG-Formade);
• Декапептид-29 (CG-Noverin);
• Олигопептид-62 (CG-Liftin);
• Олигопептид-34 (CG-TGP2);
• Олигопептид-24 (CG-EDP3);
• Олигопептид-72 (CG-boostrin);
• Олигопептид-51 (CG-purilux);
• Ацетил декапептид-3 (Rejuline);
• Гиалуроновая кислота 1,5% (15 мг/мл);
• 24 аминокислоты;
• 14 витаминов (A, B6, E, B1, B7, B8, B2, K, I, B3, B12, B9, B5, C);
• 8 минералов и коэнзимов;
• нуклеиновые кислоты;
• антиоксиданты.

Далее, подробнее об ингредиентах, входящих в состав продукции линии Aquashine.

ГК обеспечивает глубокое увлажнение кожи, а также выполняет транспортную функцию для остальных активных веществ.

Гиалуроновая кислота является важным компонентом в организме человека, выполняя защитные и другие биологически активные функции. Ее уникальные физико-химические и биологические свойства, в том числе биосовместимость и высокая гидрофильность, позволяют использовать ГК в различных областях медицины в виде гелей и пленок. Растворы ГК обладают уникальными реологическими свойствами, которые позволяют этому полимеру вести себя подобно вязкоупругому гелю даже при низких концентрациях [35].

ГК относится к группе соединений, называемых гликозаминогликанами или кислыми мукополисахаридами. Это вещество заполняет внеклеточные пространства между волокнами коллагена. Он идентичен по химической и молекулярной форме во всех тканях млекопитающих и поэтому является неспецифичным для вида. ГК имеет простую химическую структуру: линейный полисахарид из повторяющихся дисахаридных звеньев N- ацетилглюкозамина и D-глюкуроновой кислоты.

 В несшитом виде это текучий раствор, склонный к быстрому разложению и именно это делает ГК идеальным средством для коррекции дефектов кожи.

Формула гиалуроновой кислоты

Основным отличием препаратов Aquashine от других продуктов, предназначенных для биоревитализации, является наличие в составе синтетических пептидов. Именно они являются ключевыми ингредиентами в составе данной линии препаратов. Каждый отдельно взятый пептид, находящийся в ингредиентном листе препарата, несёт в себя различные свойства, которые позволяют бороться с различными дефектами кожи.

INCI: Oligopeptide-24 (CG-EDP3). Это синтетический пептид, содержащий 13 аминокислот, состоящий из: аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, изолейцина, глутаминовой кислоты, глицина, метионина и тирозина. Олигопептид-24 — это пептид, полученный из эластина, который усиливает экспрессию эластина и гиалуроновой кислоты и повышает активность фибробластов.          Он используется в косметике в качестве средства против морщин и укрепляющего средства. Исследования in vitro показали, что олигопептид-24 увеличивает концентрацию эндогенного фактора роста в коже даже в десять раз по сравнению с контролем [36,37]. Молекулярный вес: 1 271,4 Да

INCI: Acetyl-Decapeptide-3 (Rejuline). Это синтетический пептид, состоящий из тирозина, аргинина, серина, лизина, треонина и триптофана. Ацетил декапептид-3 — это пептид, который стимулирует коллаген и эластин для повышения эластичности кожи, увеличения роста клеток.    Ацетил декапептид-3 является продуктом, образованным реакцией уксусной кислоты и декапептида-3 Молекулярный вес: 1450,599 Да

INCI: Oligopeptide-51 (CG-Purilux). Это синтетический пептид, содержащий 11 аминокислот, состоящий из аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глицина, лейцина, серина, треонина и тирозина.  Олигопептид-51 угнетает активность и выработку меланоцитов, стимулирует образование новых клеток кожи, волокон эластина и коллагена, сокращает поры за счет угнетения производства липидов, из которых синтезируется себум (кожное сало). Молекулярный вес: 1210,3 Да

INCI: Decapeptide-29 (CG-Noverin). Это синтетический пептид, состоящий из аргинина, аспарагина, цистеина, гистидина, фенилаланина и валина. Декапептид-29 представляет собой белый раствор. Уменьшает и предотвращает появление морщин, блокируя функцию MMP2, активно генерируя новые клетки кожи. Также обладает противовоспалительным свойством, выравнивает рельеф кожного покрова.

Молекулярный вес: 1 072,2 Да

INCI: Oligopeptide-62 (CG-Liftin). Данный пептид представляет собой синтетический пептид, содержащий 12 аминокислот, состоящий из аргинина, аспарагина, цистеина, глицина, лейцина, лизина, фенилаланина и тирозина. Олигопептид-62 продлевает жизненный цикл кожных клеток, повышает эластичность дермы, улучшает ее цвет, оказывает эффект лифтинга. Молекулярный вес: 1473,7 Да

INCI: Octapeptide-11 (CG- Seperin). Cинтетический пептид, состоящий из цистеина, изолейцина, метионина, пролина, серина и тирозина. Октапептид-11 – омолаживает кожу, благодаря активации процесса деления клеток. Благодаря этому улучшается тонус кожи, обеспечивается глубокий лифтинг-эффект. Молекулярный вес: 1075,16 Да

Сложный комплекс действующих веществ восстанавливает активность ферментных систем организма, повышает антиоксидантную защиту, оказывает регулирующее действие и балансируют состояние кожи. Аминокислоты являются “строительным материалом” для синтеза белков. Нуклеиновые кислоты используются для синтеза новой ДНК при делении клеток.

Антиоксиданты очень полезные активные ингредиенты для изготовления косметики. Как правило, антиоксиданты прерывают реакции окисления и предотвращают воздействие кислородных радикалов (например, пероксидов) на оба процесса. С одной стороны, они предотвращают разложение натуральных ингредиентов (белков, сахаров, липидов) в косметическом продукте. С другой стороны, антиоксиданты защищают клетки кожи от повреждения и замедляют процесс старения. Было показано, что антиоксиданты улучшают сияние кожи, минимизируют возрастные пятна, солнечные пятна и тонкие линии.

Также в рецептуре используются следующие 14 витаминов: аскорбиновая кислота (С), ретинол (А), тиамин (В1), рибофлавин (В2), никотин (В3), пантотен (B5), пиридоксин (В6), биотин (B7), инозитол (B8), фолиевая кислота (B9), цианокобаламин (В12), токоферол (E), филлохинон (K), — питают и лечат.

Витамин Е является важным жирорастворимым антиоксидантом и используется в дерматологии более 50 лет. Это важный ингредиент во многих косметических продуктах. Он защищает кожу от различных вредных воздействий солнечного излучения, выступая в качестве поглотителя свободных радикалов.

Витамин С способен предотвращать дефекты из-за чрезмерного пребывания на солнце, курения или стресса, а также проблем, связанных с окружающей средой. Велика взаимосвязь между уровнем витамина С в организме и общим состоянием кожи [38]. Высокая концентрация витамина С в коже указывает на то, что он обладает рядом важных биологических функций, которые важны для здоровья кожи. Основываясь на том, что мы знаем о функции витамина С, внимание было сосредоточено на образовании коллагена и антиоксидантной защите.

Витамин А, или ретинол, является одним из наиболее широко признанных питательных веществ для здоровой кожи. Синтетические ретиноиды использовались в качестве эффективных средств для лечения угрей и псориаза с 1980-х годов, демонстрируя таким образом, насколько полезен витамин А для лечения проблемной кожи. Недостаток витамина А вызывает кератинизацию и шелушение кожи, а секреция слизи подавляется.

Витамин B3 может помочь при некоторых признаках старения кожи. В особенности это касается уменьшения появления пигментных пятен и других форм изменения цвета кожи.

Витамин В5 предотвращает потерю воды и помогает удерживать влагу. Это, в свою очередь, предотвращает сухость кожи, шелушение и зуд, а также поддерживает её мягкость и эластичность.

Витамин В6, также известный как пиридоксин, требуется организму для развития красных кровяных клеток, которые помогают восстановлению клеток кожи. Витамин B6 также помогает регулировать нарушения гормонов, которые могут вызывать обострение угревой сыпи.

Коэнзимы является питательным - витаминоподобным веществом, которое играет решающую роль в выработке клеточной энергии и в очистке организма от свободных радикалов.

3.2 Материалы и методы исследования

Для проведения экспериментальной части нам было необходимо выделить культуру клеток фибробластов из предоставленного образца кожи человека.Фибробласты легко культивируются и поддерживаются в лабораторных условиях.

Исторически, линии фибробластов человека, были получены из биопсий пациентов и использовались в ряде исследований для выяснения патогенеза некоторых заболеваний [39]. Фибробласты получают из биоптатов кожи посредством ферментативной обработки или механической дезагрегации образцов. В настоящее время наиболее часто используют ферментативный способ получения первичной культуры. На скорость роста и свойства фибробластов в культуре оказывают влияние следующие факторы: количество пассажей, способ культивирования, тип используемых сред и сывороток [40].
При проведении исследований тех или иных косметических или медицинских препаратов достаточно распространён метод Кунса или подругому он называется иммунофлуоресцентный анализ. Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году.

 В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом, и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.

При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

 При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем.

Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом. Работа была подразделена на 4 этапа:

1. Выделение фибробластов из доставленного в лабораторию образца кожи человека;

2. Пассирование полученной культуры клеток;

3. Окрашивание иммунофлуоресцентным методом;

4. Морфометрический анализ.

3.3 Выделение культуры фибробластов и пассирование

Для получения суспензии клеток пуповину измельчали ножницами до кусочков размером 3-4 мм и помещали в раствор коллагеназы I типа в среде МЕМ. Полученную суспензию клеток осаждали при 1G в течение 5 мин, после чего был удален супернатант, а затем осадок клеток ресуспендировали в смеси

среды M199. Полученный материал перенесли во флакон и поместили в термостат. Через 5-7 дней первичная культура достигала монослоя.

Пассирование культуры фибробластов человека до 7 пассажа. Пассирование производилось через 3 дня на четвертый, когда культура достигала состояние монослоя. Методика пересеивания культуры фибробластов:

1. Культуральная среда удалялась из флаконов (флакона) с помощью стерильной пипетки.

2. Для удаления остатков среды и мертвых клеток проводилась промывка в двух сменах DPBS без Ca²⁺ и Mg²⁺ по 5 мл на флакон.

3. Для снятия клеток с подложки использовался раствор трипсин-версена (Gibco), который добавляли по 500 мкл на флакон, время действия 3-5 мин при температуре 37°С.

4. Открепление клеток контролировалось под микроскопом.

5. Для блокирования ферментативной реакции добавляли питательную среду по 5 мл на флакон.

6. Затем суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 1G. Этот пассаж считали нулевым. Посевная концентрация составляла примерно 50 тыс. клеток на мл. Исследуемый препарат Aquashine вводится, начиная с 1 пассажа (доза – 2,0 мл препарата развести физиологическим раствором до 10,0мл). Препарат вводится при каждом пассаже (до 7 пассажа).

 3.4 Окрашивание препаратов культуры фибробластов человека иммунофлуоресцентным методом

Выявление маркерных молекул осуществлялось иммунофлуоресцентным методом с использованием первичных антител.

Таблица 1. Используемые антитела

№	Название	Фирма	Разведение
1.	Mouse monoclonal TRF1 antibody	Abcam	1:100
2.	Rabbit polyclonal Calreticulin antibody	Abcam	1:200

В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam) антитела. Протокол выполнения данной экспериментальной работы был предоставлен компанией ABCAM [41].

1. Промывка* клеточной культуры раствором PBS.

2. Фиксация клеток: для фиксации используется 4% параформальдегид на PBS (инкубация в течение 15 минут при комнатной температуре).

3. Промывка раствором PBS (три смены по 3 минуты).

4. Отмывка дистиллированной водой (3 минуты).

 5. Необходимо пермеабилизировать клетку, если исследуемый белок – внутриклеточный. Пермеабилизация клеток осуществляется 0,25-0,5% раствором Triton X-100 на PBS (Биолот, РФ) в течение 15 минут при комнатной температуре.

6. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).

7. Инкубация в 1% бычьем сывороточном альбумине, разведенным PBS, pH 7,5 в течение 15 минут для блокировки неспецифического связывания.

8. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).

 9. Инкубация с первичными антителами (см. Табл.1) (время и условия инкубации установлены производителем в инструкции к а/т).

10. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).

11. Инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor (в разведении 1:1000) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.

12. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).

13. Ядра клеток докрасить Hoechst 33258 (разведение 1:100 от стокового раствора в dH2O; Sigma, США) в течение 1 минуты.

14. Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).

15. Готовые препараты заключить под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Хранить в темноте, во избежание быстрого выгорания флуорохрома.

* Промывка необходима для того, чтобы субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов, удаляются при многократной промывке.

3.4 Морфометрический анализ

Для анализа полученных результатов использовали конфокальный микроскоп Olympus FluoView 1000 (Япония) и программное обеспечение «Vidеotest Morphology 5.2».

Площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер.

Рисунок 11. Olympus FluoView 1000

Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной токи объекта.

Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки 11 оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.

Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Следует сделать вывод, что изучение биологической активности линии инъекционных препаратов с использованием синтетических пептидов показало несомненно высокую физиологическую активность пептидных регуляторов и перспективность их дальнейшего использования. Пептиды обладают способностью регулировать экспрессию генов, которая является их ключевым свойством. Фактически они представляют собой биотехнологическую копию активного фрагмента более крупных регуляторных пептидов. Следовательно, биомиметические пептиды легче достигают рецепторов клеток-мишеней, фокус их действия более направленный, и они имеют меньший аллергический потенциал.

Еще одной особенностью биомиметических пептидов является то, что они действуют не только по принципу «заместительной терапии», восполняя дефицит в тканях различных факторов роста и контактируя с клеточными рецепторами. Они также модулируют активность генетического аппарата клетки и регуляторные процессы таким образом, что переводят клетку на наиболее рациональный режим функционирования.

На молекулярном уровне целевое воздействие биомиметических пептидов заключается в усилении экспрессии генов и активизации синтеза следующих основных сигнальных молекул: противовоспалительных интерлейкинов, эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов, инсулиноподобного фактора роста, внутриклеточных молекул адгезии, тромбоцитарного фактора роста, антиапоптозных факторов и др. С возрастом образование этих молекул снижается, что является одной из причин появления признаков старения кожи: изменения ее структуры, нарушения кровоснабжения клеток, усиления пигментации, снижения степени иммунной активности, замедления роста придатков кожи, включая волосы. Воздействие биомиметических пептидов приводит к положительному влиянию на такие важные патогенетические механизмы старения, как апоптоз (самопроизвольная гибель клеток), пролиферация (клеточное обновление) и хроническое иммунное воспаление.

Важно подчеркнуть, что каждый конкретный биомиметический пептид обладает совершенно определенным действием, которое определяется его химическим строением. То, какой вид сигнальных молекул будет вырабатываться в тканях при воздействии пептида, определяется последовательностью аминокислот в его цепочке и спецификой воздействия на клеточное ядро.

Результаты данного исследования убедительно демонстрируют эффективность пептидного комплекса Aquashine и подтверждают ее объективными морфологическими исследованиями. Исследованные параметры имеют неразрывную связь с клиническими проявлениями старения кожи и борьбы с ними.

Под действием пептидного комплекса Aquashine значительно повышается синтетическая активность фибробластов, что подтверждается повышением экспрессии TERF1 и кальретикулина. Под воздействием новой линии препаратов Aquashine в культуре клеток фибробластов наблюдалось активация экспрессии TERF-1, что способствует стабильности теломер хромосом и, таким образом, защищает клетки от преждевременного старения.

При введении новой линии препаратов Aquashine in vitro было показано увелечение площади экспрессии кальретикулина в фибробластах, что свидетельствует об усилении внутриклеточного синтеза белков. Это способствует жизнеспособности кожи и препятствует ее преждевременному старению.

Проведённые исследования убедительно продемонстрировали высокую активность препарата. Это позволяет с позиций доказательной медицины экстраполировать полученные результаты на клиническое использование и прогнозировать выраженный эффект лифтинга, уплотнения кожи и её омоложения при использовании Aquashine в программах anti-age коррекции.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.     Baumann L. Skin ageing and its treatment // The Journal of Pathology -2007. V. 211 №2 P.241–251

2.     Quan T, Fisher GJ. Role of age-associated alterations of the dermal extracellular matrix microenvironment in human skin aging: a mini-review // Gerontology – 2015. V. 61. №5. Р.427–434.

3.     Fields, K.; Falla, T.J.; Rodan, K.; Bush, L. Bioactive peptides: Signaling the future // Journal of Cosmetic Dermatology - 2009. V. 8. P. 8–13.

4.     Peptide Therapeutics Market (by Applications, by Route of Administration, and by Marketing Status)—Global Industry Analysis, Size, Share, Growth, Trends and Forecast 2014–2020 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.transparencymarketresearch.com/pressrelease/peptide-therapeutics-market.htmd (Дата обращения 13.02 2019).

5.     Gaspar, P.K. Neuropeptides in the skin // The journal Brazilian Annals of Dermatology – 2003.V. 78. P. 483–498.

6.     Scholzen, T.; Armstrong, C.; Burnett, N.; Luger, T.; Olerud, J.; Ansel, J. Neuropeptides in the skin: Interactions between the neuroendocrine and the skin immune systems // Experimental Dermatologyl – 1998.V. 7. P. 81–96.

7.     Guimaraes, D.E.D.; Sardinha, F.L.C.; Mizurini, D.M.; Carmo, M.G.T. Adipocinas: Uma nova visão do tecido adipose // The Revista de Nutrição – 2007.V.20.P.549–559.

8.     Claeys, I.; Simonet, G.; Poels, J.; Loy, T.V.; Vercamme, L.; Loof, A.; Broeck, J.V. Insulin-related peptides and their conserved signal transduction pathway // Peptides – 2002. V.23. P.807–816.

9.     Lima, T.N. & Moraes, C.A.P. Bioactive Peptides: Applications and Relevance for Cosmeceuticals // Cosmetics -2018. V. 5. №1. P. 21

10.                       Pickart, L.; Schagen, S. New data of the Cosmeceutical and tripeptide GHK // The SOFW Journal - 2015.V.9.P.48-54

11.                       Fekkes, Peter & Driessen, Arnold.  Protein Targeting to the Bacterial Cytoplasmic Membrane // Microbiology and molecular biology reviews MMBR – 1999.V.63. P.161-73.

12.                       Smith, E.W. and Maibach, H.I. Percutaneous Penetration Enhancers, - 2nd ed.- New York: Taylor and Francis Group, New York,2006 – p.26

13.                       Borgia, JA, Fields, GB. Chemical synthesis of proteins // Trends in Biotechnology – 2000. V. 18. №6. P. 243.

14.                       Andreu D, Rivas L, Chemistry and applications of synthetic antimicrobial peptides. Peptide antibiotics: discovery, modes of action, and applications. New York: Marcel Dekker Inc. p. 15–45

15.                        Amparo S, Alberto Chisvert -1^st ed.-Italy: Elsevier, - 2007, p.38

16.                       Machado A, Liria CW, Proti PB, Remuzgo C, Miranda MTM.Sínteses química e enzimática de peptídeos: princípios básicos e aplicações // Quim Nova -2004. V.27. №1. P.781–9

17.                       So JE, Kang SH, Kim BG.Lipase‐catalyzed synthesis of peptides containing D‐amino acid: facts and artifacts // Enzyme and Microbial Technology. 1998.V.l23 №3. P.211–215

18.                       Ogino H, Yamada M, Watanabe F, Ichinose H, Yasuda M, Ishikawa H 1999. Peptide synthesis catalyzed by organic solvent‐stable protease from Pseudomonas aeruginosa PST‐01 in monophasic aqueous‐organic solvent systems // Journal of Bioscience and Bioengineering.1999. V.88 №5. Р.513–18.

19.                       Wang Q, Zhu F, Xin Y, Liu J, Luo L, Yin Z 2011. Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli // Biotechnolgy Letters – 2011. V.33. №11. P. 1–6

20.                       Huang Y.-L., Ma M.-F., Chow C.-J., Tsai Y.-H. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory and hypocholesterolemic activities: Effects of protein hydrolysates prepared from Achatina fulica snail foot muscle // International Journal of Food Properties – 2017.V.20. №12. P.3102-3111.

21.                        peptides in Escherichia coli: a review// Protein Expression and Purification – 2011.V. 80. №2. Р260–267

22.                       Scholzen, T.; Armstrong, C.; Burnett, N.; Luger, T.; Olerud, J.; Ansel, J. Neuropeptides in the skin: Interactions between the neuroendocrine and the skin immune systems // Experimental Dermatology -2007. V.7. № 2-3. P.27.- [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1600-0625.1998.tb00307.x

23.                       (Дата обращения:14.04.2019).

24.                       Kaspar, J.M. Reichert Future directions for peptide therapeutics development // Drug Discovery Today -2013. V.18.P.  807-817.

25.                       Maia Campos, P.M.G.; Mercúrio, D.G.; Tadini, K.A. Acetyl hexapeptide-3 in a cosmetic formulation acts on skin mechanical properties—Clinical study // The Brazilian Journal of Pharmaceutical Science – 2015. V. 51. P. 901–909

26.                       Blanes-Mira, C.; Clemente, J.; Jodas, G.; Gil, A.; Fernández-Ballester, G.; Ponsati, B.; Gutierrez, L.; Pérez-Payá, E.; Ferre-Montiel, A. A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity // International Journal of Cosmetic Science – 2002. V. 24. P. 303–310.

27.                       Finkey, M.B., Appa, Y. and Bhandarkar, S. Copper peptide and skin. In: Cosmeceuticals and Active Cosmetics, -2nd ed- New York; Marcel Dekker, 2005 p. 549–564.

28.                       Sharma, Shrikant & Singh, Raghvendar & Rana, Shashank. Review Article Bioactive Peptides: A Review // International Journal Bioautomation -2012 V. 15. P.223

29.                       Aikaterini A Zompra, Athanassios S Galanis, Oleg Werbitzky, and Fernando Albericio, Manufacturing peptides as active pharmaceutical ingredients // Future Medicinal Chemistry – 2009. V.1. №2. Р.361-377

30.                       Пай В.В., Бхандари П., Шукла П. Актуальные пептиды как ингредиент космецевтики // Indian Journal of Dermatology, Venereology, Leprology – 2017.V.83.P. 9-18

31.                       Aubert G, Lansdorp PM: Telomeres and aging // Physiological Reviews - 2008. V.88. №2. P.557–579.

32.                       Hohensinner P.J., Kaun C., Buchberger E., Ebenbauer B. et al. Age intrinsic loss of telomere protection via TRF1 reduction in endothelial cells // Biochimica et Biophysica Acta. - 2016. - V. 1863. - P. 360 –367

33.                       Michalak, M. Calreticulin: one protein, one gene, many funcctions / M. Michalak, E. F. Corbett, N. Mesaeli // Biochemical Journal. - 1999. V.2. - P. 281- 292.

34.                       Yang S., Liu T., Li S., Zhang X. et al. Comparative proteomic analysis of brains of naturally aging mice // Neuroscience. - 2008.  V. 154.  № 3. P. 1107-1120.

35.                       Derevyanko A, Whittemore K, Schneider RP, Jiménez V, Bosch F, Blasco MA. Gene therapy with the TRF1 telomere gene rescues decreased TRF1 levels with aging and prolongs mouse health span // Aging Cell – 2017.V.16. №6. P.1353–1368.

36.       Filion M. C., Phillips N.C. Патент США №7125858. Hyaluronic acid in the treatment of cancer.

37.       Ribeiro, A. S., Estanqueiro, M., Oliveira, M. B., Sousa Lobo, J. M., Main benefits and applicability of plant extracts in skin care products // Cosmetics – 2015.V. 2. P. 48– 65.

38.       Lupo, M. P., Cole, A. L., Cosmeceutical peptides // Dermatologic Therapy-2007. V.20.P 343– 349.

39.       Сигаева Н. Н., Колесов С. В., Назаров П. В., Вильданова Р. Р. Химическая модификация гиалуроновой кислоты и ее применение в медицине // Вестник Башкирского университета - 2012. Т.3., - [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/himicheskaya-modifikatsiya-gialuronovoy-kisloty-i-ee-primenenie-v-meditsine (Дата обращения: 06.05.2019). 

40.                        Пэкер Л., Фукс Дж., Редакторы. Витамин С в здоровье и болезни. - 1-е; Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США: изд. Marcel Dekker, Inc, 1997. - С. 1–24.

41.                       Villegas J, McPhau Nl (2005) Establishment and culture of human skin fibroblasts. Curr Protoc Mol Biol Chapter 28: Unit 28 3 

42.                       Зорин В. Л., Зорина А. И., Петракова О. С., Черкасов В. Р. Дермальные фибробласты для лечения дефектов кожи // Гены и клетки - 2009. №4. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/dermalnye-fibroblasty-dlya-lecheniya-defektov-kozhi (дата обращения: 14.05.2019). 

43.  Протокол для иммунофлуоресцентного анализа ABCAM  [Электронный ресурс].–